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Introducción
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae son los patógenos que con mayor frecuencia causan las conjuntivitis bacterianas 1-3. Sin embargo, existe una amplia variedad de bacterias oportunistas, especialmente de la microbiota de piel y mucosas, que está asociada con infecciones de la superficie ocular, y dentro de las cuales el Staphylococcus epidermidis es la especie de estafilococos coagulasa negativos (ECN) más identificada (>50 %) en la conjuntivitis bacteriana 75 % 4,5. Otras especies de ECN, como S. hominis, S. haemolyticus y S. warneri, también se han documentado como agentes causales de patologías oculares 6,7.
El género Staphylococcus tiene más de 50 especies, de las cuales el S. aureus es el patógeno más significativo del grupo, caracterizado por la presencia diversos genes de virulencia y por su capacidad de adquirir rápidamente resistencia a los antimicrobianos (RAM) 8,9, por lo que para la Organización Mundial de la Salud es una de las bacterias prioritarias para la vigilancia de RAM 8.
Por lo general, las infecciones bacterianas de la conjuntiva son autolimitadas, por lo que, en la mayoría de los casos, no se realiza una identificación microbiològica ni pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, aunque sí se formulan antibióticos tópicos, de acuerdo con la clínica del paciente, los cuales son de venta libre en el comercio de muchos países. De esta manera, la RAM de las bacterias aisladas de infecciones o de la microbiota del ojo se asocian con el tiempo y con la regularidad en la administración de antimicrobianos, lo cual aumenta así la tasa de resistencia a estos fármacos 10,11.
Los programas de monitoreo de la RAM, Antibiotic Resistance Monitoring in Ocular Microorganisms y Tracking Resistance in U. S., coinciden en que el microorganismo más prevalente fue el S. aureus, al ser en un alto porcentaje meticilino resistente (SAMR) (>40 °%) y por presentar una alta resistencia a macrólidos, quinolonas y aminoglucósidos. Igualmente, más del 50 °% de los ECN fueron meticilino resistentes y más del 60 °% de estas bacterias también tenían resistencia a azitromicina y ciprofloxacina 12,13. En una revisión de la literatura de la RAM en aislados oculares, se encontró que en América (Estados Unidos, México, Colombia, Cuba, Venezuela, Brasil y Paraguay), el S. aureus y los ECN son resistentes principalmente a macrólidos y betalactámicos 14.
El incremento en la RAM en las bacterias patógenas, oportunistas y comensales ha llevado a que frente al S. aureus se busquen alternativas de tratamiento en las plantas medicinales. En este sentido, se han identificado varios extractos de plantas con actividad antimicrobiana. A manera de ejemplo, se encuentra los de Euterpe oleracea de hojas de diferentes especies de Ocimum, con altas concentraciones terpenoides, que además potencian la actividad antibiótica de la norfloxacina 15-17; los de semillas de Lycium shawii y Phyllanthus emblica, con cantidades considerables de alcaloides, compuestos fenólicos y flavonoides, que destruyen la pared de la bacteria 18; los aceites esenciales de Laurus nobilis, que inhiben la formación de biopelículas, y los de Persicaria pensylvanica, con efecto bactericida 19,20.
Dada la amplia distribución y la creciente RAM de las diferentes especies de Staphylococcus y su importancia en la salud de la superficie ocular, el objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas frente a especies de este género, aisladas de pacientes con conjuntivitis bacteriana, para identificar especies que en un futuro puedan ser consideradas alternativas en el tratamiento tópico de las infecciones de la conjuntiva.
Materiales y métodos
Aislamiento e identificación
En la clínica de Optometría de la Universidad de La Salle (Bogotá, Colombia) se diagnosticaron 15 pacientes, teniendo en cuenta los siguientes criterios de inclusión: manifestaciones clínicas de conjuntivitis bacterianas y que no tuvieran tratamiento con antibiótico en el momento de la recolección del material de análisis. A cada uno se le realizó frotis de la conjuntiva tarsal inferior con un escobillón estéril, el cual se inoculó en un tubo con medio de transporte Stuart, COPAN (Innovation, Italia).
Las muestras se transportaron en un plazo menor a 24 horas al laboratorio y se cultivaron en agar sangre y chocolate durante 24 h a 37 °C. Las colonias se identificaron con coloración de Gram y se procedió a realizar repique en agar tripticasa de soya. Las colonias aisladas se llevaron a una concentración de 1.5 x 108 bacterias/mL en una solución salina estéril al 0.45 °% con un pH de 7.0 (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Francia), la cual se determinó con el DensiCHECK Plus (BioMerieux) en el rango de medida entre 0.44 y 0.56 unidades de la Escala de McFarland, para su posterior identificación en el sistema automatizado VITEK® (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Francia), con el uso de las tarjetas VITEK® 2-GP (referencia 21342).
En resumen, a cada tubo con la suspensión bacteriana se le colocó la respectiva tarjeta y se llevó a la primera cámara del equipo, donde se llenó la tarjeta mediante vacío. De esta forma, la dilución de la bacteria se distribuyó en los 64 sustratos para medir las actividades metabólicas, como acidificación, alcalinización e hidrólisis enzimática. Así, la tarjeta se incubó en la segunda cámara del equipo a 35.5 ± 1.0 °C, donde cada 15 min el equipo realizó una lectura de transmitancia a tres diferentes longitudes de onda del espectro visible, para interpretar las reacciones de turbidez o colorimétricas en cada uno de los 64 sustratos.
Al finalizar la incubación (18 a 24 h), de manera automatizada, el equipo determinó si cada reacción fue positiva, negativa o débil. Finalmente, el software del equipo reconoció el microorganismo, comparando los resultados con bases de datos de los productos de identificación construidos con un gran número de cepas de microorganismos perfectamente caracterizados, provenientes de fuentes clínicas, colecciones de cultivo públicas (ATCC) y universitarias, para dar la identificación del género y especie de los aislamientos bacterianos.
Test de susceptibilidad antimicrobiana
A las bacterias identificadas como Staphylococcus se les realizó antibiograma utilizando el método de Kirby-Bauer, descrito por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 21, en el cual las bacterias seleccionadas se sembraron por agotamiento en agar tripticasa de soya durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, cada aislamiento se llevó a una concentración de 1.5 x 108 bacterias/mL.
Así mismo, 100 de la dilución de las bacterias se adicionó en agar Mueller-Hinton y se sembró de manera masiva. Luego se colocaron los sensidiscos individuales recomendados por el CLSI para el género Staphylococcus: oxacilina (1 mg), cefoxitina (30 mg), eritromicina (15 mg), gentamicina (10 mg), tobramicina (10 mg), tetraciclina (30 mg), ciprofloxacina (5 mg) y vancomicina (30 mg) (Oxoid Ltda., Reino Unido). Las cajas se incubaron a 37 °C durante 24 h y se midieron los halos de inhibición alrededor de los sensidiscos. Los tamaños de las zonas de inhibición se interpretaron como: R (resistente), I (resistente intermedio) y S (sensible), teniendo en cuenta los puntos de corte reportados por el CLSI 21.
Extractos de plantas
De acuerdo con el análisis cuantitativo de la información etnomedicinal, se seleccionaron siete plantas: laurel, albahaca, sauco, poleo, caléndula, belladona y achiote (hojas y fruto), por ofrecer el mayor factor de consenso entre informantes de plazas de mercado de Bogotá para el tratamiento de infecciones oculares 22. Estas provienen de varios municipios del país y se adquirieron de manera comercial en plazas de mercado de Bogotá y un ejemplar de cada una de las especies fue depositado en Herbario-Museo de La Salle (Bogotá, Colombia) para su identificación taxonómica (tabla 1).
Tabla 1 Identificación taxonómica, procedencia y número de colección del material vegetal empleado en el estudio
| Nombre científico | Familia | Nombre común | Nombre de la plaza de mercado* | Código de herbario |
|---|---|---|---|---|
| Ocimum basilicum | Lamiaceae | Albahaca | Ferias | 15421 |
| Calendula officinalis | Asteraceae | Caléndula | Engativá | 15422 |
| Delphinium elatum | Ranunculaceae | Sauco | Ferias | 15424 |
| Sambucus nigra L. | Adoxaceae | Belladona | Restrepo | 15426 |
| Clinopodium brownei | Lamiaceae | Poleo | Restrepo | 15432 |
| Laurus nobilis | Lauraceae | Laurel | Restrepo | 15433 |
* Lugar donde fue adquirido el material vegetal.
Para la obtención de los extractos, se utilizaron 500 g del material vegetal limpio, molido y seco; posteriormente, el material se sometió a maceración en frío con etanol al 96 °% durante 15 días en una proporción 1:2. Semanalmente, se removió el solvente por destilación a presión reducida a 200 mbar y 50 °C para obtener los extractos crudos.
Actividad antimicrobiana de los extractos de plantas
La actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas se llevó a cabo mediante la técnica de microdilución en un microplaca de 96 pozos. El ensayo de inhibición del crecimiento se adaptó del reportado por Famuyide et al. 23. Para esto, los extractos se disolvieron en dime-tilsulfóxido al 10 °% (DMSO) (Sigma Aldrich) a una concentración final de 60 mg/mL, de la cual se dispensó un volumen de 100 en cada pozo de la placa. Posteriormente, se adicionaron 100 de la bacteria a una concentración de 1.5 x 108 bacterias/mL en medio BHI (Merck), para un volumen final de 200 ^L.
Para cada aislamiento se utilizaron los siguientes controles: medio de cultivo BHI y DMSO al 10 °%, ciprofloxacina a 100 mg/mL (Oxoid), y como control de esterilidad se utilizó el medio de cultivo sin bacteria. Cada uno de los ensayos con los extractos y controles se realizó por triplicado. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. Finalizado el tiempo de incubación,
se adicionaron 40 de resazurina 2mg/mL (Sigma, Aldrich), un revelador que cambia de color frente a la cantidad de dióxido de carbono producido durante el metabolismo bacteriano, donde un color rosado indicaba viabilidad del cultivo, y el color azul, que no hubo crecimiento bacteriano.
A los extractos que presentaron actividad antimicrobiana frente al 100 °% de los aislamientos se les determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI), mediante diluciones dobles seriadas en un rango de 30 mg/mL a 0.9 mg/mL. La CMI se consideró la concentración más baja de la dilución del extracto ensayado necesaria para inhibir el crecimiento visible de las bacterias con resazurina. Como controles para todas las técnicas empleadas en esta investigación, se utilizaron las cepas: ATCC® 43300 de SAMR (positiva al gen mecA) y ATCC® 25923 SAMS (negativa al gen mecA).
Análisis estadístico
Los datos se organizaron y tabularon. Se calcularon las medidas de tendencia central, además de que se establecieron frecuencias de los microorganismos aislados.
Consideraciones éticas
Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de La Salle, a través del Acta 027 del 16 de noviembre de 2016, donde se evidenciaba su participación libre y voluntaria, su conocimiento del objetivo de la investigación, los procedimientos y los riesgos que estos podían causar.
Resultados
e los 15 pacientes se obtuvieron 12 aislamientos del género Staphylococcus: S. epidermidis (41.7 °%), S. hominis (25 °%), S. aureus (25 °%), y un aislamiento (8.3 °%) de S. warneri. Este último fue sensible a todos los antibióticos analizados, mientras que el S. aureus fue la especie que presentó la mayor RAM, principalmente a oxacilina, tetraciclinas y vancomicina. Las especies de ECN, S. hominis y S. epidermidis, fueron resistentes principalmente a eritromicina (figura 1). Los perfiles de RAM mostraron un aislamiento SARM y tres multirresistentes (tabla 2).
FOX: cefoxitina, OXA: oxacilina, VAN: vancomicina, GEN: gentamicina, TOB: tobramicina, CIP: ciprofloxacina, E: eritromicina, TE: tetraciclina, RAM: resistencia antimicrobiana.
Figura 1. Resistencia antimicrobiana de especies de Staphylococcus aisladas de pacientes con conjuntivitis
Tabla 2 Actividad antimicrobiana de ocho extractos de plantas frente a cada especie de Staphylococcus aislada de pacientes con conjuntivitis
*Se muestra el perfil de resistencia antimicrobiana (RAM) de cada aislamiento y las cepas ATCC.
FOX: cefoxitina; OXA: oxacilina; VAN: vancomicina; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; CIP: ciprofloxacina; E: eritromicina; TE: tetraciclina; IC: inhibición del crecimiento bacteriano; C: crecimiento bacteriano; MR: fenotipo multirresistente.
Los extractos de L. nobilis y O. basilicum presentaron actividad antimicrobiana frente a todos los aislamientos de Staphylococcus, incluso frente a los multirresistentes. Los extractos de S. nigra, C. brownei y C. officinalis presentaron actividad antimicrobiana frente a 5 aislamientos, y los de D. elatum y B. orellana, frente a 4 aislamientos. En general, los extractos analizados tuvieron menor actividad antimicrobiana frente a las bacterias multirresistentes (tabla 2).
La tabla 3 muestra las CMI de los extractos de las plantas que presentaron actividad antimicrobiana frente al 100 % de los aislamientos de Staphylococcus. El extracto de L. nobilis tuvo una CMI menor a 0.9 mg/mL para todos los aislamientos, y para el extracto de O. basilicum se obtuvieron valores de CMI que oscilaron entre 0.9 y 15 mg/mL (tabla 3).
Tabla 3 CMI de los extractos etanólicos de L. nobilis y O. basilicum, frente a especies de Staphylococcus aisladas de pacientes con infección ocular
| Aislamiento | L. nobilis | O. basilicum |
|---|---|---|
| mg/mL | ||
| S. aureus ( SARM ) | <0.9 | 15 |
| S. aureus | <0.9 | 7.5 |
| S. aureus | <0.9 | 15 |
| S. epidermidis | <0.9 | <0.9 |
| S. epidermidis | <0.9 | <0.9 |
| S. epidermidis | <0.9 | 7.5 |
| S. epidermidis | <0.9 | 7.5 |
| S. epidermidis | <0.9 | 7.5 |
| S. hominis | <0.9 | 7.5 |
| S. hominis | <0.9 | 7.5 |
| S. hominis | <0.9 | 15 |
| S. warneri | <0.9 | <0.9 |
| S. aureus ATCC 43300 | 1.8 | 15 |
| S.aureus ATCC 25923 | <0.9 | 15 |
Discusión
Los microorganismos más aislados en los pacientes con conjuntivitis fueron S. epidermidis y S. aureus, resultados que concuerdan con lo reportado en el 2005, en el estudio realizado en la Clínica de Optometría de la Universidad de La Salle, donde el 43 °% de los casos de conjuntivitis fueron ocasionados por S. epidermidis, y el 30 °%, por S. aureus5.
Adicionalmente, los resultados encontrados en esta investigación coinciden con lo indicado en la literatura sobre el tema, donde la mayor resistencia de Staphylococcus aislados de infecciones oculares se presenta frente a los betalactámicos, macrólidos y tetraciclinas 24,25.
El extracto de O. basilicum tuvo la mayor actividad antimicrobiana frente a todos los aislados clínicos de Staphylococcus, incluso los multirresistentes. Esta planta es muy utilizada en todo el mundo para múltiples afecciones, gracias a la diversidad de compuestos que contiene, como antocianinas, ácido cafeico, ácido rosmarínico, flavonas, alanina, arginina, metionina, ácido ascórbico, ácido aspártico, fitosteroles, tiamina, esculetina, riboflavina, ácido glutámico, entre otros 26,27. El contenido de estos compuestos varía de acuerdo con las condiciones climatológicas y geográficas y genera una respuesta que puede potenciar la actividad antimicrobiana de las especies 28, como se pudo evidenciar al comparar los resultados de este estudio con los reportados por Hernández y Rodríguez, en el 2001, quienes obtuvieron una CMI de 8.3 mg/mL para O. basilicum, y de 4.19 mg/mL para los dos microorganismos: S. aureus y S. epidermidis29. De forma similar al presente trabajo, también se ha documentado actividad antimicrobiana para extractos crudos metanólicos de O. basilicum a una concentración de 0.5 mg/mL 30.
El extracto obtenido de L. nobilis fue el otro que presentó actividad antimicrobiana frente a todas las bacterias estudiadas en esta investigación, aunque en concentraciones más altas que la O. basilicum, ya que la CMI estuvo en un rango entre 7.5 y 15 mg/mL. Estos valores son similares a la CMI de 10 mg/mL reportada para el aceite esencial de esta planta frente a S. aureus ATCC 25923 o frente a aislados clínicos de S. aureus, con un valor en el rango entre 15.6 y 31.3 mg/mL, y en los cuales se ha atribuido la actividad de este aceite a la presencia de 1.8-cineole, un compuesto con prometedora actividad antimicrobiana e inhibidor en la formación de biopelículas 19,31.
Se han confirmado científicamente los efectos terapéuticos de la caléndula frente a infecciones de piel y mucosas, acompañados de propiedades antinflamatorias reconocidas tradicionalmente y confirmadas para esta especie vegetal, como se observó en un estudio en que los extractos obtenidos de la caléndula presentaron una actividad antimicrobiana significativa, lo cual se correlaciona con los reportes previos 32. Estos hallazgos demuestran el potencial terapéutico de los extractos de plantas como alternativa terapéutica de uso oftálmico tanto en animales como en humanos. Por lo tanto, los resultados de esta investigación son relevantes, debido a que orientan la búsqueda de principios activos en estas plantas para ser evaluados frente a S. aureus y S. epidermidis, los principales agentes etiológicos de las infecciones de la superficie ocular y, de esta forma, obtener una alternativa medicinal que ayude a disminuir el uso de antibióticos tópicos, principalmente en infecciones autolimitadas, como las conjuntivitis bacterianas.
Este incremento en las tasas de RAM ha generado la búsqueda de alternativas que minimicen los efectos adversos de los antibióticos. En este sentido, las plantas medicinales se constituyen en una excelente estrategia por su baja toxicidad y bajo costo y porque reducirían la RAM 33. Esto explica la importancia de los resultados obtenidos en este estudio, que evidenciaron el potencial de los extractos obtenidos de las plantas medicinales y dieron alcance a los objetivos propuestos en esta investigación.
En este sentido, es importante continuar con otros estudios que estén orientados a la identificación de los compuestos bioactivos de las especies con mayor potencial antimicrobiano; así como otros orientados hacia la estandarización de extractos, con el fin de determinar si el perfil químico y el potencial biológico cambian significativamente con el tipo de material (cultivo o silvestre), tiempo de colecta, lugar de colecta, entre otros aspectos.
Se concluye con la evidencia encontrada que los extractos de plantas O. basilicum, L. nobilis y C. officinalis presentan alta actividad antimicrobiana frente a bacterias aisladas de infecciones oculares, incluso aquellas que presentaron multirresistencia antimicrobiana, al ofrecer una posible propuesta medicinal con varias alternativas que se deben estudiar.
Agradecimientos
Las autoras agradecen a la Universidad de La Salle, por la financiación del proyecto.
Contribución de los autores
Ludy C. Pabón B: contribución en la concepción y diseño experimental, trabajo de laboratorio, obtención de datos e información, análisis e interpretación de resultados; planeación, diseño, elaboración, revisión y aprobación final de la versión final artículo que se aceptó para publicar.
Juliana Granados Flórez: toma de muestras, trabajo de laboratorio, obtención de datos e información; planeación, diseño, elaboración, revisión y aprobación final de la versión final artículo que se aceptó para publicar.
Martha Fabiola Rodríguez Álvarez: contribución en la concepción y diseño experimental, trabajo de laboratorio, obtención de datos e información, análisis e interpretación de resultados; planeación, diseño, elaboración, revisión y aprobación final de la versión final artículo que se aceptó para publicar.
Patricia Hernández-Rodríguez: contribución en la concepción y diseño experimental, trabajo de laboratorio, obtención de datos e información, análisis e interpretación de resultados; planeación, diseño, elaboración, revisión y aprobación final de la versión final artículo que se aceptó para publicar.
Wendy Johana Velasco: trabajo de laboratorio, obtención de datos e información; planeación, diseño, elaboración, revisión y aprobación final de la versión final artículo que se aceptó para publicar.
