Determinación de factores de adhesión asociados a la formación de biopelícula en aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis

Pinilla, Gladys; Bautista, Angela; Cruz, Claudia; Chavarro, Bibiana; Navarrete, Jeannette; Muñoz, Liliana; Gutiérrez, Jennifer; Pinilla, Gladys; Bautista, Angela; Cruz, Claudia; Chavarro, Bibiana; Navarrete, Jeannette; Muñoz, Liliana; Gutiérrez, Jennifer

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Print version ISSN 1794-2470

Nova vol.15 no.27 Bogotá Jan./June 2017

Articulo producto de la investigación

Determinación de factores de adhesión asociados a la formación de biopelícula en aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis

Determination of adhesion factors associated with biofilm formation in clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

Gladys Pinilla¹

Angela Bautista²

Claudia Cruz²

Bibiana Chavarro¹

Jeannette Navarrete¹

Liliana Muñoz¹

Jennifer Gutiérrez¹

¹ Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de Bacteriología y Laboratorio clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Colombia

^² Semillero Grupo REMA, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Colombia Correspondencia: gpinillab@unicolmayor.edu.co

Resumen

Los factores de adhesión son determinantes de virulencia que se expresan en microorganismos que tienen la capacidad de formar biopelícula, contribuyendo a la gravedad de infecciones intrahospitalarias. Dentro de estos componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas de adhesión de matriz conocidas como MSCRAMMs, se incluyen el factor de unión a fibronectina A y B, (FnbA y B) factor de aglutinación A y B (ClfA y B) y factor de unión a fibrinógeno (Fib), que se han descrito en Staphylococcus aureus y reaccionan con proteínas de la matriz extracelular humana. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de estos factores de adhesión relacionados con la formación de biopelicula en Staphylococcus.

Método.

Se caracterizaron fenotípica y genotípicamente 30 aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, provenientes de pacientes inmunocomprometidos en tres instituciones hospitalarias de Bogotá. La producción de Biopelícula se determinó mediante Rojo Congo y Cristal violeta y mediante PCR convencional y múltiplex se amplificaron los genes FnbA y B, ClfA y B y Fib, así como los genes del operón ica ADBC.

Resultados.

Todos los aislamientos clínicos fueron positivos genotípica y fenotípicamente para la producción de Biopelícula, encontrándose la presencia del operón completo en el 88.9%, los factores ClfA y ClfB en un 70%; Fib en un 60%, FnbB en un 23% y FnbA en el 17%.

Conclusiones.

En este estudio se evidenció la presencia de estos factores de virulencia en S. epidermidis, los cuáles hasta el momento se han reportado únicamente en S.aureus. Este hallazgo es importante ya que se sugiere la relación con transferencia horizontal de genes entre estas especies, siendo el S. epidermidis un importante reservorio genético, y un importante patobionte causal de infecciones nosocomiales, asociado con dispositivos médicos.

Palabras claves: Biopelícula; factores de adhesión; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis

Abstract

Adhesion factors are virulence determinants that are expressed in microorganisms with the ability to form biofilms, contributing to the severity of nosocomial infections. Among these microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs), are fibronectin binding A and B (fnbA and B) clumping A and B (ClfA and B) and fibrinogen binding (Fib) factors. All of these have been described in Staphylococcus aureus and react with human extracellular matrix proteins. The goal of this study was to determine adhesion factors related to the biofilm formation in Staphylococcus.

Method.

For these purpose, 30 clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, from immunocompromised patients in three hospitals in Bogotá were characterized both, genotypically and phenotypically. The biofilm formation was determined through Congo Red and Violet Crystal and the genes FnbA, B, ClfA, B, Fib and operon ica ADBC were amplified through conventional and multiplex PCR.

Results.

Every clinical isolate were genotypically and phenotypically positive for the biofilm formation, being found the presence of the whole ica ADBC operon in 88,9%. The ClfA and ClfB were found by 70%; Fib 60%, fnbB 23% and 17% offnbA.

Conclusions.

This study proved the presence of these virulence factors in S. epidermidis, which so far have only been reported in S. aureus. This finding is important because it suggestes the relationship with horizontal gene transfer between these species, being the S. epidermidis an important genetic reservoir and a causal patobiont of nosocomial infections associated with medical devices.

Keywords: Biofilm; adhesion factors; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis

Introducción

Los Staphylococcus spp involucrados en infecciones intrahospitalarias han desarrollado varios mecanis mos de resistencia antimicrobiana, como la forma ción de biopelícula mediada por el operón icaA-DBC, contribuyendo a la gravedad de la infección, por disminución en la absorción del antibiótico; y por ende, la persistencia del patógeno ¹^,².

Los patógenos nosocomiales involucrados en este tipo de infecciones son principalmente Staphylo-coccus aureus y Staphylococcus epidermidis que se comportan como patógenos oportunistas, catalo gados según el microbioma humano como pato-biontes en personas inmunocomprometidas y que presentan un gran potencial de formar biopelícula, ya que se encuentra en piel y en superficies muco sas, los cuales pueden ser introducidos a los tejidos durante la implantación de dispositivos médicos ³^,⁴.

Dentro de los actores principales en el proceso de formación de biopelícula, se han descrito una serie de moléculas denominadas factores de adhesión, que son moléculas de tipo proteico que expresa la bacteria para facilitar su adhesión a una superficie, siendo este el primer y determinante paso en el es tablecimiento de una película bacteriana ⁴.

Comúnmente estos factores de adhesión o pro teínas son referenciadas como moléculas de la matriz de adherencia o MSCRAMMs (por sus siglas en inglés: Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules), de las que se conoce que tienen la capacidad de unirse a la matriz extracelular de proteínas del plasma del huésped tales como: fibrinógeno, fibronectina, colágeno, vitronectina y laminina ⁴^-⁶. Estudios realizados en S. aureus han descrito una serie de genes que codifican para diferentes MSCRAM-Ms; los genes ClfA, ClfB y fib que codifican para proteínas de unión al fibrinógeno y las proteínas de unión a la fibronectina, codificadas por los ge nes fnbA y fnbB, proteínas denominadas de igual forma que sus genes codificantes ⁷^-⁹.

Específicamente el factor Clumping o de aglutina ción A, codificado por el gen ClfA, fue el primer MSCRAMM identificado, es el más conservado entre especies y facilita la unión del patógeno a el C-terminal de la cadena gamma del fibrinógeno presente en el plasma sanguíneo del huésped ⁶. A su vez este ha demostrado promover la evasión bacteriana de la defensa del huésped, en parte por la inhibición del proceso de fagocitosis realizado por neutrófilos y macrófagos a través de mecanis mos dependientes e independientes al fibrinógeno ⁷. El factor Clumping o de aglutinación B (ClfB) es una adhesina bifuncional que se ex presa únicamente en la superficie celular durante la fase exponencial de crecimiento y es capaz de unirse a las cadenas alfa del fibrinógeno, así como a la citoqueratina diez (CK10), una proteína es tructural de las células epiteliales escamosas, por lo que ha sido implicado en la colonización del S. aureus en el epitelio nasal ¹⁰^,¹¹.

Las proteínas de unión a la fibronectina (FnbA) y (FnbB) se han identificado en los géneros Sta-phylococcus y Streptococcus¹². Son proteínas co dificadas por genes estrechamente vinculados, ya que poseen una alta homología en su secuencia. Estas trabajan juntas para el establecimiento de la infección y son indispensables en la adhesión inicial del S. aureus al epitelio. La FnbA es indis pensable en la internalización de las bacterias a la célula huésped mientras que la FnbB estimula la fagocitosis ¹³.

Estas proteínas tienen la capacidad de unirse al fibrinógeno y a la elastina gracias al dominio N-terminal que poseen ¹⁴; seguido por una región que contiene 11 repeticiones de aminoácidos en el caso de la FnbA y 10 repeticiones para la FnbB que son las responsables de que se dé la unión con la fibronectina, permitiendo así la invasión de células endoteliales por parte del Staphylococcus aureus¹⁵^-¹⁶.

Dado que estos factores de adhesión (ClfA, ClfB, FnbA, FnbB y fib) hasta el momento han sido reportados solo en S. aureus, en este estudio se pretende evidenciar si se encuentran presentes también en S epidermidis. Este hallazgo sería im portante ya que se sabe poco acerca de cómo S. epidermidis interactúa con proteínas de la matriz, siendo este el agente causal de infección en mayor frecuencia en pacientes neonatales e inmunocomprometidos, y por lo tanto, un potente patobionte.

Metodología

Aislamientos bacterianos

Se analizaron 30 cepas de Staphylococcus spp pro venientes de pacientes de tres instituciones hos pitalarias de Tercer Nivel de Bogotá, que pre sentaron infecciones asociadas con implantes de dispositivos médicos. Estos aislamientos fueron caracterizados fenotípica y genotípicamente para confirmación de especie y se determinó la capaci dad para formar biopelícula, mediante agar rojo congo y cristal violeta, para verificar la adherencia bacteriana valorada semicuantitativamente por la técnica propuesta por Freeman y colaboradores ¹⁷^,¹⁸.

Extracción de ADN

La extracción de ADN se llevó a cabo mediante pretratamiento con lisozima 2,5mg/ml y lisostafina 1,2 mg/ml a una temperatura de 37°C por 60 minutos y se siguió el protocolo para bacterias Gram positivas de Wizard® Genomic DNA Puri fication Kit (Promega, Winsconsin USA)

Determinación de la presencia de los genes del operon ica y de factores de adhesión

La detección de los genes que componen el operón ica ADBC e ica R, encargado de mediar la formación de biopelícula en S. epidermidis y S. aureus, se realizó mediante la técnica de PCR múltiplex, usando las siguientes condiciones: MgCl2 2,5μM; dNTPs 200 luM; 0,25^M de cada primer y Taq polimerasa 1U (invitrogen, Ca lifornia, USA). Las condiciones de amplificación fueron 30 ciclos: denaturación a 94° C por 15 segundos, hibridación a 55° C por 30 segundos y elongación por 1 minuto a 72°C. Se utilizaron las cepas USA 300 y la ATCC 12228 como controles positivo y negativo, respectivamente.

Para la amplificación de adhesinas (clfA, clfB, fib, fnbA y fnbB) se realizó PCR múltiplex, utilizando los cebadores descritos por Tristan et al ¹⁹, con las siguientes condiciones: MgCl2 2mM; dNTPs 200|iM; cebadores 0,5μM de cada gen y Taq polimerasa 1,25U (invitrogen, California, USA), durante 25 ciclos: desnaturalización por 1 minu to, hibridación a 55°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 1 minuto. Se utilizaron las cepas USA 300 y la ATCC 12228 como controles positivo y negativo, respectivamente.

Resultados

Aislamientos clínicos

Se estableció la relación entre la especie de Staphylococcus y el tipo de muestra obtenida por cada entidad participante en el estudio encontrando que la frecuencia de aislamientos fue para S. epidermidis (80%) y para S. aureus (20%). En las 3 instituciones hospitalarias el mayor porcentaje de aislamientos tanto de S. epidermidis como S. aureus fue proveniente de muestras de hemocultivos, seguido de puntas de catéter. Adicionalmen te, se encontró que la mayoría de los aislamientos clínicos en este estudio provenían de pacientes en estado de inmunosupresión (datos no mostrados).

Determinación de las MSCRAMMs

Se amplificaron fragmentos de los genes que co difican factores de adhesión clfA, clfB, fib, fnbB, y fnbA mediante PCR multiplex (Figuras 1 y 2); los genes clfA, clfB fueron los mayormente encontra dos (70%), seguidos de fib (60%), fnbB (23%) y fnbA (17%).

Figura 1 Productos de Amplificación de los factores de adhesión clfA, clfB, fib, y fnbB mediante PCR multiplex: Carriles. 1. marca dor de peso molecular, 2.control positivo para clfA, clfB, fib, y fnbB cepa USA 300 S. aureus, 3 al 11. Aislamientos clínicos positivos para los factores ClfA (292pb), ClfB (205 pb), FnbB (524pb) y fib (404 pb).

Figura 2 Frecuencia de cada factor de adhesión según el tipo de Staphylococcus en cada uno de los tipos de muestra analizados.

Factores de adhesión y tipo de muestra

Se estableció la correlación entre la presencia de cada factor vs. la especie de Staphylococcus y sitio de infección, y se encontró que los genes que co difican para los factores de adhesión analizados en este estudio y hallados en S. aureus fueron todos provenientes de hemocultivos y no se encontró el gen fnbB en ninguna de las muestras analiza das. Para S. epidermidis todos los factores se en contraron en mayor proporción en muestras de hemocultivo y punta de catéter; sin embargo, no se hallaron los factores en la muestra de absceso analizada. Los factores más frecuentes en todas las muestras fueron clfA, clfB y fib,Figura 2.

Caracterización fenotípica y genotípica de la biopelícula

Los aislamientos clínicos estudiados, presentaron las pruebas cualitativas de rojo congo, y semicuantitativa de cristal violeta positivas y la frecuencia de aparición de los genes del operón ica ADBC e ica R fue la siguiente: presencia de los 5 genes, es decir, del operón completo, 88.9%; cuatro de los genes (ica R, ica DBC), 7,4% y dos de los genes (ica R, icaD), 3,7%

Discusión

En el presente estudio se evidenció que compo nentes de la superficie microbiana, que recono cen moléculas de adhesión a la matriz extracelular, conocidas como MSCRAMMs, considerados factores de virulencia en Staphylococcus, específi camente descritas para S. aureus, se encuentran presentes también en aislamientos clínicos de S. epidermidis. Este hallazgo es importante ya que este último microorganismo, considerado co mensal de piel, o autobionte, es en la actualidad un importante reservorio genético, y a su vez, de bido a la transferencia horizontal de genes entre estas especies, ha pasado a ser considerado potencial patobionte, dentro de la clasificación del Microbioma humano. Adicionalmente, proporciona información acerca de cómo S. epidermidis podría interactúar con proteínas de la matriz extracelular humana y su relación con la formación de biopelícula, siendo este un importante factor de persistencia bacteriana en infecciones frecuentes en pacientes neonatales e inmunocomprometidos ²⁰. No obstante a pesar de que existe mucha información sobre MSCRAMMs en Staphylocuccus, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares por los cuales estas proteínas conducen a la adhe sión bacteriana ²¹.

Las adhesinas ClfA, fnbA y fnbB se unen a los resi duos C- terminal de la cadena Y del fibrinógeno, la cual es una región que está involucrada en la agregación plaquetaria; en Staphylococcus epidermidis la adhesina propia de éste, la sdrG se une a la cadena (3 del fibrinógeno, el cual es un sitio de clivaje para la trombina, lo que hace que estos Staphylococcus al inmovilizar el fibrinógeno, estén involucrados en el desarrollo de aterosclerosis, trombosis, CID, y por tanto, en el riesgo de en fermedad cardiovascular ²².

Significativamente todos los residuos de ClfB que se unen a la citoqueratina 10 (K10) y a la cadena a del fibrinógeno son péptidos conservados en Staphylococcus aureus, representando 48 variantes únicas de la proteína. Es así como Asn-238 y Thr-383 interactúan con el fibrinógeno pero no con la citoqueratina, mientras que la Gly-521 hace con tacto únicamente con esta ²³.

En este estudio los genes codificantes de las adhesinas ClfA, ClfB y fib se encontraron en los mismos tipos de muestras: hemocultivos, puntas de catéter, secreciones oro-traqueales y herida de miembro inferior derecho y hueso. Este hallazgo podría estar relacionado con la similitud estruc tural existente entre ClfA y fib, ya que se ha de mostrado que ambas proteínas en el dominio A N-terminal poseen tres subdominios N1, N2 y N3; los aminoácidos del subdominio N1 de ClfA y fib tienen el 19% de identidad, mientras que los subdominios N2 y N3 comparten alrededor del 60% de identidad ²⁴.

Las MSCRAMMs FnbA y FnbB promueven la acumulación de la biopelícula en cepas de Staphylococcus aureus con resistencia a la meticilina (MRSA). Es así como cepas MRSA pueden expre sar proteínas de superficie tales como Bap, SasG, SasC, FnbA y FnbB que promueven la acumula ción en la formación de biopelícula de manera independiente del operón icaADBC ²⁵.

La FnbA y la FnbB median la acumulación bacte riana requiriendo Zn+₂. Se ha encontrado que al remover el Zn+₂ utilizando DTPA como quelante, se inhibe la acumulación bacteriana, pero no afecta la expresión o la integridad de las proteínas lo que implica que ambas proteínas promueven la formación de biofilm por un mecanismo depen diente del Zn+²²⁶.

Los resultados obtenidos en el presente traba jo muestran que FnbA fue la MSCRAMMs con menor frecuencia, con un 17% del total de los aislamientos, hallándose únicamente en hemocultivos y en punta de catéter. FnbB solo se halló en aislamientos de S. epidermidis a partir de hemocultivos, puntas de catéter, secreción orotraqueal y esputo. No obstante, dada la importancia que tienen estos factores en la formación de bio-películas bacterianas, es necesario determinar no solo la presencia de los genes que codifican para estos factores sino también la expresión genética de estos.

En cuanto a la prevalencia de las MSCRAMMs en Staphylococcus relacionados con sepsis, se re porta que ClfA está presente en el 100% de los aislamientos, ClfB entre el 98 y 100 %, fib está presente en un 90 a 100 %; mientras que el FnbB sí varia en Staphylococcus sensibles a meticilina (MSSA), donde se encuentra en el 30% de los ais lamientos mientras que en Staphylococcus resisten tes (MRSA) se reporta entre 53.3 a 50% y para el FnbA se encuentra entre el 100 y el 63.6% ²⁴.

En la presente investigación se encontró ClfA y ClfB en un 70%, Fib en un 60%, FnbB en un 23% y FnbA en el 17% de los aislamientos clí nicos, evidenciando una alta frecuencia de estas adhesinas en pacientes inmunosuprimidos. Staphylococcus tienen la capacidad de ser internali zados por diversos tipos de células como: células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, osteoblastos, queratinocitos, además de los fagoci tos comunes. Es importante destacar que la ex presión de estas MSCRAMMs no siempre sigue un patrón, aunque algunas sean más conservadas que otras ²⁴.

S. epidermidis es un microorganismo comensal humano lo que hace de esta bacteria un soporte y reservorio óptimo para la transferencia de genes de resistencia. Por ejemplo, se habla que S. epidermidis posee elementos genéticos móviles nombra dos como casetes cromosómicos (SCCmec) que hacen que aumente la resistencia a la meticilina, por lo que ha sugerido que estos casetes fueron transferidos de S. epidermidis a S. aureus²⁷.

La transferencia genética en las biopelículas de S. aureus se da por medio de plásmidos a través de conjugación y movilización, lo que determina la resistencia a antibióticos y la transferencia de adhesinas (MSCRAMMs) para la formación de la biopelícula. Así mismo se sabe que casi todos los patógenos bacterianos formadores de biopelícula contienen mecanismos de transferencia génica horizontal inducibles ²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹; en este contexto en nuestro estudio se plantea que pueden ser éstos los responsables de la trans ferencia de las MSMCRAMS entre S. aureus y epidermidis, efectuada mediante la combinación de elementos genéticos móviles. Lo anterior se plantea con base en Investigaciones anteriores, en las cuales evidenciamos en los aislamientos clíni cos estudiados en el presente trabajo, la presencia de plásmidos con la capacidad de transportar integrones que confieren mecanismos de resis tencia a las bacterias, mediante la inclusión de casetes genéticos, lo que posiblemente explicaría el encontrar estos genes que inicialmente solo se reportaron para S. aureus, también en S. epidermidis, hallazgo soportado por el mecanismo de transferencia horizontal de genes ³²^,³³.

Se sugiere que las cepas de relevancia clínica con tienen plásmidos conjugativos que facilitan la for mación de la biopelícula; un ejemplo de ello es Escherichia coli, que codifica el plásmido F que actúa como un factor de adhesión en la superficie celular actuando en las interacciones de célula a célula para la conformación de biopelículas ³⁴. No obstante es importante mencionar que mu chos organismos que no pueden transportar plásmidos producen solo microcolonias pero no biopelícula, pero cuando estos organismos reciben plásmidos de bacterias donantes, estos empiezan a producir biopelículas ³⁵^-³⁷.

Por otra parte, varios autores relacionan que las cepas que poseen el operón icaADBC forman ne cesariamente biopelícula, mientras que otros, sos tienen que la presencia del operón no es suficien te sino que son necesarios otros factores como las autolisinas, MSCRAMMs, etc.; Sin embargo y dada la importancia de este cluster genético en relación al papel que cumple en la formación de biopelícula, Pinilla y colaboradores identificaron la presencia del operón ica ADBC en el 88% de los aislamientos clinicos y el 90% de estas poseían el regulador negativo icaR, lo cual llevó al diseño de péptidos análogos a icaR con especi ficidad antibiopelícula, como posible alternativa terapéutica ²⁸^,³¹^,³².

Las MSCRAMMs no se encontraron en todos los aislamientos a pesar de que estos fueron for madores de biopelículas determinada tanto fenotípica, como genotípicamente. Esto podría explicarse por las combinaciones individuales entre MSCRAMMs, que influencian sucesos mi crobianos de adhesión o pueden generar la no expresión completa de los mismos; además de que se pueden presentar variaciones alélicas entre adhesinas del mismo tipo que pueden aumentar o reducir su unión a las células humanas ²⁴.

Por otra parte, se destaca que en las tres insti tuciones hospitalarias, se evidenció una alta fre cuencia de MSCRAMMs en hemocultivos. Las MSCRAMMs que han sido más asociadas a la in fección en el torrente sanguíneo son ClfA y FnbA, produciendo así mismo fuertes biopelículas. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis son responsables de más de la mitad de todas las infecciones nosocomiales sanguíneas en Estados Unidos ³⁸.

Staphylococcus epidermidis reporta una alta resis tencia bacteriana en hemocultivos reportándose una mortalidad entre el 18% a 57%. En biopelículas que se forman en implantes óseos, el 80% de ellas están siendo causadas por especies de S. aureus y S. epidermidis³⁹.

En cuanto a las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la biopelícula se encuentran el diseño y uso de vacunas, la terapia génica, alter nativas de prevención de formación de biopelícula evitando la adherencia y la proliferación bac teriana, lo que permite el control de las células en fase planctónica, por medio de los tratamientos de la superficie del implante o dispositivo médico ⁴⁰^-⁴².

Finalmente, el estudio de las MSCRAMMs es de suma importancia ya que no solo permiten la unión a las proteínas de la matriz extracelular, sino que permiten la acumulación y proliferación bacteriana, convirtiéndolas en uno de los factores de virulencia más importantes promovidos por la biopelícula y de esta forma, constituirse en un blanco terapéutico importante para controlar su formación y por ende disminuir la virulencia del patógeno.

Agradecimientos

Este proyecto fue financiado por la Universi dad Colegio Mayor de Cundinamarca y COLCIENCIAS Convocatoria 657-2014 Código COL0041221, Contrato RC651-2014.

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Recibido: 16 de Noviembre de 2016; Aprobado: 12 de Diciembre de 2016

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