Introducción

A pesar de los desafíos bioéticos, la utilización de células humanas que pretenden ser utilizadas con fines terapéuticos ha ganado mucho espacio en los últimos años. Hoy por hoy, la obtención de un número suficiente de células capaces de generar satisfactoriamente una regeneración, luego de haber sido aisladas in vitro y amplificadas para ser trasplantadas en sitios anatómicos específicos, es un aspecto prioritario a resolver. Múltiples ensayos clínicos desarrollados en la actualidad ponen en evidencia la necesidad de grandes cantidades de células con propósitos terapéuticos ^1,2.

La obtención de un óptimo crecimiento en cultivos celulares in vitro y de las cantidades requeridas, manteniendo las características fenotípicas de las células, sus funciones y su estado de diferenciación dependen de ambientes de cultivo capaces de imitar aquellas encontradas en las condiciones fisiológicas in vivo e in situ. Estos entornos deben considerar elementos fundamentales como la temperatura, el pH, oxígeno y la osmolaridad ³. El medio ambiente donde se desarrollan las células en cultivo debe contar con un soporte celular (caja de Petri), que gracias a sus condiciones especiales de revestimiento, permitirán la fijación y el buen desarrollo de las células.

Por su parte, el medio de cultivo es el responsable de proporcionar todos los tipos de moléculas solubles, nutrientes, hormonas, factores de crecimiento y suplementos necesarios para las células ⁴. El suplemento de los medios de cultivos más comúnmente utilizado es el Suero Fetal Bovino (SFB). El SFB es un componente esencial en la proliferación y la diferenciación de las células, incluidas las humanas. Este suplemento se obtiene de la sangre colectada a partir de punciones cardiacas de fetos bovinos luego de su nacimiento ^5,6. Son varias las funciones del SFB, entre ellas, proporcionar hormonas, proteínas, factores de estabilización y detoxificación necesarias para la células, así como factores de crecimiento activadores de los complejos de transcripción ⁷.

Un tipo celular prometedor en la terapia de diversas patologías humanas son los fibroblastos gingivales (FGs), principales células del tejido conjuntivo gingival, que por su plasticidad y actividad inmunomoduladoras son bastantes útiles en la terapia celular; gracias, además, a la facilidad técnica para su aislamiento y proliferación ⁸. Aunado a ello, recientemente se ha establecido que una población de FGs presentan características de multipotencialidad y autorrenovación prometedoras en la terapia celular ⁹. Probablemente sea esta la razón por la cual los FGs llevan cabo un proceso reparador de heridas más rápido cuando se compara con fibroblastos de otros tejidos.

Aunque el SFB es usado tradicionalmente en las investigaciones, como todo producto de origen animal implica riesgos de xeno-inmunización y transmisión zoonótica en caso de ser usados con fines terapéuticos en humanos. Por ello, con el propósito de evaluar la supervivencia de FGs humanas en ausencia de SFB y avanzar en su uso terapéutico, es preciso conocer su comportamiento en estas condiciones; y en consecuencia, encontrar métodos de cultivos alternativos, económicos y éticos que no implique el uso de productos derivados de animales. El presente trabajo tiene como objetivo conocer y describir el impacto de la ausencia en la suplementación de SFB en la supervivencia de fibroblastos gingivales en cultivos.

Materiales y métodos

Resultados

La supervivencia de los fibroblastos gingivales fue evaluada en cultivos celulares suplementados con 0.2% de SFB y en su ausencia. En las dos condiciones creadas los FGs mostraron aspectos microscópicos compatibles con la vida durante 7 días de cultivo celular. Los FGs presentaron una forma fusiforme y presencia de múltiples prolongaciones citoplasmáticas que permitieron el contacto entre los fibroblastos. Los FGs tuvieron un crecimiento diferencial en su proliferación de acuerdo a la suplementación con SFB. En la condición de cultivo 1 (DMEM+SFB 0,2%) se pudo observar una confluencia de células de alrededor 60%-70% posterior a 72 horas de cultivo, mientras que los FGs cultivados en ausencia de SFB presentaron una confluencia aproximada del 40% durante el mismo periodo de tiempo (ver Figura 1).

Fuente: Elaboración propia.

Figura 1 Fibroblastos gingivales de 72 horas cultivados en presencia de SFB 0.2% (A) y ausencia de SFB (B). DMEM: Dulbecco's Modified of Eagle Medium. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca: 400 µm. 

Al mismo tiempo, se pudo evidenciar la presencia de FGs con núcleos ovalados, bien definidos y distribuidos en el soporte del cultivo celular. Estas características fueron apreciables en los FGs cultivados en 0.2% de SFB y ausencia de este suplemento (ver Figura 2). Durante el tiempo de cultivo, se pudo constatar la presencia no cuantificable de numerosas células flotantes desde las primeras 24 horas, que fueron disminuyendo con el pasar de los días de cultivo celular. Estas observaciones fueron visibles en ambas condiciones evaluadas, pero fueron más marcadas en los FGs cultivados en ausencia de SFB.

Fuente: Elaboración propia.

Figura 2 Núcleos de fibroblastos gingivales marcados con Hoechst cultivados en SFB 0.2% (A) y SFB 0% (B). DMEM: Dulbecco's Modified of Eagle Medium. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca: 200 µm. 

Posterior a 7 días de cultivo se identificó por medio de inmunofluorescencia la presencia de los filamentos de actina. La evaluación de un elemento esencial en la arquitectura del citoesqueleto de los FGs como es la actina, fue observada en aquellas células cultivas en 0.2% y ausencia de SFB. Se evidencia un número mayor de células con marcaje con la faloidina que exponen un contacto intercelular entre los FGs del grupo de células suplementadas con 0.2% de SFB en comparación con el grupo de FGs sin suplementación (ver Figura 3. A, D).

Fuente: Elaboración propia.

Figura 3 Identificación de los filamentos de actina (rojo) y mitocondrias (verde) de fibroblastos gingivales mediante la técnica de inmunofluorescencia. Doble marcaje: actina (faloidina)-mitocondrias (TOMM20) de fibroblastos gingivales en cultivo suplementado con SFB 0.2% (A,B,C) y SFB 0% (D,E,F). DMEM: Dulbecco's Modified of Eagle Medium. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca: 200 µm. 

De manera similar, fue detectada la presencia de las mitocondrias en las dos condiciones de cultivos realizadas (ver Figura 3. B, E). El inmunomarcaje de estas organelas celulares fue muy similar en los FGs cultivados con 0.2% y ausencia de SFB. Tanto el marcaje de los filamentos de actina como de las mitocondrias mediante colocalización inmunofluorescente (ver Figura 3. C, F) permiten mencionar que no existe diferencias morfológicas en la localización de estos elementos celulares en los dos grupos analizados.

Discusión

Este estudio ha puesto en evidencia la supervivencia de los FGs humanos cultivados en ausencia de suplementación con SFB en un medio de cultivo. Cada vez más estudios similares al actual se interesan en la generación de cultivo de FGs humanos en ausencia de SFB debido a las variaciones encontradas lote a lote de este suplemento y a la inadecuada aplicación clínica de los FGs en humanos cuando se emplean productos de origen animal ¹⁰. Aunque el trabajo actual se limita al impacto de la concentración de SFB, es importante haber identificado que los FGs pueden llegar a ser cultivables en ausencia de SFB sin sufrir alteraciones morfológicas y probablemente funcionales.

La concentración diferencial de suplementación con SFB en los FGs permiten manifestar que la ausencia de este elemento es compatible con la supervivencia, aspectos morfológicos y probablemente funcionales de estas células. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, junto aquellos de estudios recientemente publicados dan muestra de cómo el SFB afecta el rendimiento y proliferación de los cultivos celulares ^11,12. Por ello, con el propósito de hacer posible la proliferación de células y evitando la utilización de medios de cultivos suplementados con SFB, en los equipos de investigación en la actualidad, como el presente, se declara el deseo de orientarse en los laboratorios hacia los suplementos de medios de origen humanos, autógenos o alógenos, siempre que estos sean capaces de mostrar una efectividad igual o superior al SFB en la proliferación de FGs in vitro.

Los resultados expuestos permiten inferir que aunque en mínimas concentraciones, los aportes que puede brindar la suplementación con SFB proporciona los elementos necesarios para el óptimo desarrollo de los FGs, entre ellos, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) ¹³. Han sido probablemente la ausencia de ellos y de otros componentes que han afectado el crecimiento celular cuando el SFB estuvo ausente. Sin embargo, sería interesante investigar como sustitutos del SFB, entre ellos, los derivados plaquetarios, son capaces de reemplazar estos elementos y contribuir a condiciones de cultivo compatible con la terapia celular, como lo han demostrado estudios recientes ^14-18.

La visualización de la distribución de la actina como proteína elemental en la formación del citoesqueleto que sirve como soporte de las organelas celulares, como las mitocondrias, identificadas en este trabajo, son resultados satisfactorios cuando se tiene en cuenta que los FGs fueron cultivados en ausencia o concentraciones muy bajas de SFB. Ello indicaría que al menos en un corto periodo de tiempo los FGs conservan sus estructuras morfo-funcionales. Sobre todo cuando se tiene presente que organelas como las mitocondrias participan en la supervivencia y proliferación celular gracias a la expresión coordinada de estas organelas con el núcleo ¹⁹. La identificación de la traslocasa de la membrana externa, subunidad 20 (TOM20) en FGs, hace ver que una proteína con elevado dinamismo conformacional y parte de la membrana externa mitocondrial, responsable del flujo de proteínas hacia el espacio intramembrana de la mitocondria ²⁰ no se encuentra impactada por la disminución y/o ausencia del SFB.

Los resultados expuestos en el presente trabajo permiten aseverar que los fibroblastos gingivales son células que pueden sobrevivir en ausencia de la suplementación con SFB, conservando su morfología y organelas celulares como las mitocondrias.