La adaptación de muchos organismos depende de la capacidad de aprender de eventos del ambiente y sus consecuencias. Por ejemplo, si se consume frecuentemente una droga en el mismo lugar, es probable que luego dicho contexto indique la presencia de la sustancia, es decir, que claves en el ambiente señalen o predigan la presencia o disponibilidad de la droga. Este tipo de aprendizaje, en el que los organismos aprenden a asociar eventos ambientales que funcionan como claves y consecuencias, se conoce como condicionamiento pavloviano. ^{Pavlov (1927)} mostró inicialmente que cuando se presenta un estímulo neutro seguido de un estímulo incondicionado (EI) o consecuencia (estímulo que por sí solo genera una respuesta), el estímulo inicialmente neutro provoca una respuesta similar a la del EI, pasando con ello a ser un estímulo condicionado (EC). Esto ocurriría, presumiblemente, debido a la adquisición de una asociación entre el EC y el EI, por lo cual el EC es capaz de evocar una representación o memoria del EI (e.g., ^{Rescorla & Wagner, 1972}; ^{Stout & Miller, 2007}; c.f., ^{Gallistel & Gibbon, 2000}).

Los principios del condicionamiento pavloviano han sido utilizados para explicar varias conductas problemáticas (e.g. ^{Laborda, Miguez, Pollack & Miller, 2012}). Un importante desarrollo en esta área se relaciona con la conducta adictiva, siendo el modelo pavloviano de respuesta compensatoria (^{Siegel, 1976}; Siegel, Baptista, Kim, McDonald & Weise-Kelly, 2000) productivo en investigación básica de adicción a las drogas. Este modelo propone que la asociación pavloviana entre los eventos que preceden la administración de una droga y los efectos de esta dentro del organismo sería uno de los procesos que subyacen a la tolerancia a las drogas. La tolerancia se entiende como una disminución en el efecto de una misma dosis de droga producida por su administración reiterada (Siegel, 2005; Siegel et al., 2000). Según dicho modelo, las claves que acompañan la ingesta de una droga, como el estado emocional, claves temporales, el rito de administración, entre otras, adquieren el rol de EC, mientras que los efectos de la sustancia dentro del organismo cumplirían el rol de EI. Dicho aprendizaje acerca de la relación entre los eventos previos a la ingesta de una droga y los efectos de esta permite al organismo reaccionar anticipadamente a través de respuestas condicionadas (RC) compensatorias. Estas respuestas tienen como objetivo regular las perturbaciones a la homeostasis producidas por la intromisión de la sustancia (Siegel et al., 2000; ^{Ramsay & Woods, 2014}). Las respuestas compensatorias tendrían como resultado una disminución de los efectos de una misma dosis de droga en el organismo o la utilización de mayores dosis para conseguir el mismo efecto inicial, lo que se expresa como tolerancia a los efectos de la droga.

El modelo postula, por tanto, que la tolerancia condicionada es específica a las claves predictoras del efecto que producen las drogas (^{Siegel, 1976}). La tolerancia sería mayor cuando los individuos se encuentran frente a claves que usualmente preceden al consumo de sustancias en comparación con claves no asociadas previamente (Siegel & Ramos, 2002). Por ejemplo, si el alcohol es asociado con determinadas claves (e.g., el bar en que se consume usualmente), estas producirán respuestas compensatorias que atenuarán el efecto de la droga (e.g., se necesitarán más cervezas para sentirse ebrio).

Dada esta especificidad de la tolerancia condicionada y el rol de los mecanismos pavlovianos que la explican, ha habido interés en explorar los efectos de la extinción pavloviana en tolerancia asociativa al etanol (e.g. ^{Conklin & Tiffany, 2002}; ^{Betancourt et al., 2008}; ^{Brooks, 2005}; Brooks, Vaughn, Freeman & Woods, 2004; ^{Miguez, Martínez & Betancourt, 2013}; ^{Quezada, Alarcón, Miguez & Betancourt, 2009}). La extinción se puede definir a nivel comportamental y procedural. En el último, la extinción consiste en la alteración de la relación que se ha establecido entre el EC y un EI, y a nivel conductual en la eliminación de la respuesta producto de estos procedimientos (^{Pavlov, 1927}; para una revisión véase ^{Delamater & Westbrook, 2014}). La extinción ha sido la base para el desarrollo de la terapia de exposición, la cual hoy en día es utilizada en una amplia variedad de trastornos psicológicos (^{Craske & Mystkowski, 2006}). En el caso de la tolerancia condicionada, extinguir las claves implicaría exponer a los pacientes a los estímulos asociados a la ingesta de la droga (e.g., bar, ritual de administración, parafernalia) sin que la droga sea administrada. De esta manera, las claves ya no anticipan las drogas y se aprende a no reaccionar compensatoriamente a estas. Dicha situación resulta relevante dado que las claves condicionadas al alcohol, a través de los mismos procesos compensatorios, llevan a los sujetos a consumir para mantener la homeostasis y, a su vez, al sobreconsumo para sentir los efectos usuales de la bebida.

Sin embargo, la evidencia muestra que los efectos de la extinción sobre la respuesta condicionada no son permanentes. Por ejemplo, se ha mostrado que la respuesta condicionada se recupera en caso de que el sujeto se enfrente ante el estímulo ya extinguido en un contexto diferente al de extinción (renovación; ^{Bouton, & Bolles, 1979}), con el paso del tiempo luego de la extinción (recuperación espontánea; ^{Pavlov, 1927}; ^{Rescorla, 2004}), y ante la exposición al EI posterior a la extinción (reinstalación; Rescorla & Heth, 1975). Estos fenómenos sugieren a nivel teórico que la extinción implica la formación de un nuevo aprendizaje en el que la reducción de las respuestas condicionadas a un estímulo no es producto de la eliminación del aprendizaje anterior, sino la formación de una asociación nueva y contraria a la original, la cual interfiere con la expresión del primer aprendizaje (Bouton, 1994). A nivel aplicado, estos fenómenos sugieren que los resultados de la terapia de exposición a claves, basada en el mecanismo de extinción, pueden verse afectados por recaídas.

Un procedimiento alternativo a los descritos y que también lleva a recaídas es el de rápida readquisición, la cual puede ser definida a nivel comportamental y procedural: en el segundo, consiste en presentar uno o pocos ensayos con el EC y el EI juntos; a nivel conductual implica el aumento de la respuesta, también llamado recuperación producto de la manipulación ya descrita. Por ejemplo, ^{Bouton (1986)} encontró recuperación de la respuesta en una segunda fase de condicionamiento con menor cantidad de ensayos en comparación a los que se requirieron para su adquisición. Este fenómeno tiene implicancia en la tolerancia, de esta manera, si un paciente luego de someterse exitosamente a un tratamiento de exposición a claves vuelve a consumir la droga en el mismo contexto de consumo previo, readquirirá rápidamente la tolerancia condicionada que fue atenuada por la exposición a las claves, en comparación con alguien que adquiere tolerancia por primera vez. Esta situación puede limitar la utilidad de la terapia de exposición dada la dificultad de evitar que el paciente se exponga nuevamente a una situación de consumo tras la terapia.

Considerando que los beneficios conductuales de la extinción decaen con las situaciones que inducen recaídas, se han desarrollado varias técnicas para evitar la recuperación de la respuesta tras la exposición (para una revisión, véase ^{Laborda, McConnell & Miller, 2011}). Dentro de estas se encuentra la de incrementar la cantidad de ensayos de extinción, lo que se conoce como extinción masiva. ^{Denniston, Chang y Miller (2003)} , en dos experimentos de condicionamiento al miedo en ratas, evaluaron si la extinción moderada (160 ensayos) y la extinción masiva (800 ensayos) podían atenuar la recuperación de lo extinguido en un diseño de renovación. Los resultados mostraron que la extinción masiva, pero no la extinción moderada, atenuó el efecto de renovación. En el campo de la tolerancia asociativa al etanol, ^{González, Navarro, Miguez, Betancourt y Laborda (2016)} evaluaron el efecto de la extinción masiva junto con la realización de la extinción en múltiples contextos, una segunda técnica usada para reducir recaídas. Compararon 4 grupos de ratas: un grupo recibió 12 ensayos de extinción en un solo contexto, un segundo grupo 60 ensayos en un solo contexto, un tercer grupo 12 ensayos de extinción distribuidos en 3 contextos y un cuarto grupo recibió extinción masiva (60 ensayos) divididos en 3 contextos. Los resultados de González et al. (2016) mostraron que tanto la extinción masiva como la extinción en varios contextos fueron efectivas para reducir la respuesta condicionada, aunque ambas técnicas en conjunto no fueron más efectivas que cada una por separado.

El objetivo de los presentes experimentos será evaluar la readquisición de la tolerancia al etanol tras la extinción moderada (experimento 1) y masiva (experimento 2). Cada experimento utilizó ocho ratas, las cuales fueron sometidas a un entrenamiento de adquisición, extinción y readquisición de tolerancia al etanol en una caja de plano inclinado o tilting plane (e.g., ^{Larson & Siegel, 1998}) usada para medir la respuesta de coordinación motora (ataxia) de los sujetos. El experimento 1 examinó si los sujetos mostraban rápida readquisición luego de la extinción de la tolerancia asociativa, mientras que el experimento 2 examinó si aumentar la cantidad de ensayos de extinción (extinción masiva) atenuaba la readquisición de la tolerancia asociativa al etanol. El experimento 1 es novedoso en tanto no se ha evaluado el efecto de la readquisición en la tolerancia asociativa. Si bien algunos experimentos han evaluado los efectos de la extinción de la tolerancia en presencia de los efectos del etanol (e.g., ^{González et al., 2016}), constituyendo esto en un ensayo de condicionamiento, no hay estudios que en nuestro conocimiento hayan evaluado el efecto de este ensayo en una siguiente medición. El experimento 2 extiende esta búsqueda al evaluar un número masivo de ensayos de extinción.

Experimento 1

Método

Sujetos. Los sujetos fueron 8 ratas albinas macho (Sprague-Dawley), sin experiencia previa, de aproximadamente 90 días de edad y un peso entre los 220 y 270 gramos. Las ratas fueron mantenidas en jaulas individuales con agua y alimentación libre, en un ciclo de luz-oscuridad de 16/8 horas. El Comité de Ética de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile aprobó todos los procedimientos reportados en esta investigación.

Aparatos y estímulos. El plano de deslizamiento o tilting plane es un instrumento diseñado para medir la respuesta atáxica (^{Larson & Siegel, 1998}). Esta fue comprendida como la disminución de la coordinación motora producto del consumo de etanol. Cada una de las tilting plane consistió en un corredor de plexiglás (i.e., una caja sin techo) de 60 cm de largo, 18 cm de ancho y 30 cm de alto, con bisagras en la parte inferior de uno de sus extremos, que se encontraba atornillado a una plataforma de madera bajo el plexiglas. Una manivela y un sistema de polea son operados para alzar el extremo sin bisagras. La inclinación aumenta aproximadamente a 8 grados por vuelta de la manivela y la elevación ocurre aproximadamente a 4 grados por segundo. Un transportador ubicado en el extremo con bisagra del callejón indica el ángulo de inclinación del plano.

Esta técnica permite evaluar la coordinación motora midiendo el ángulo de deslizamiento de las ratas. Se definieron conductualmente los deslizamientos como el momento cuando la rata pierde el soporte ofrecido por el apoyo de sus extremidades, comenzando así el desplazamiento hacia el ángulo que se forma entre el plano tangencial al horizonte. Cuando ocurre un deslizamiento se detiene la manivela del plano y el ángulo de inclinación es registrado (ángulo de deslizamiento). De esta manera, se mide la coordinación motora según los grados de inclinación que soportan los sujetos en la plataforma de deslizamiento. Un asistente inyectó las soluciones, manipuló la manivela del plano inclinado, infirió el deslizamiento y registró el ángulo en el que ocurrió.

Como EI se utilizó el efecto fisiológico de una inyección intraperitoneal de etanol al 99 % en una solución al 20 % en suero fisiológico. La dosis por sujeto utilizada fue de 2 g de etanol por kg de peso (^{Siegel & Larson, 1996}; Larson & Siegel, 1998; ^{Miguez et al., 2013}). Como ec se usó la inyección de la solución correspondiente para cada etapa.

Procedimiento. El diseño del experimento se encuentra ilustrado en la tabla 1.

Tabla 1 Diseño del experimento 1 

EC fue el estímulo condicionado (inyección), el EI fue el efecto de la droga.

Línea base. En el primer día de la investigación se midió el grado de deslizamiento de los sujetos en el plano en dos sesiones de 8 minutos de duración para cada sujeto para determinar las líneas base sin y con etanol, respectivamente. Dentro de cada sesión se midió el grado de deslizamiento a los 4 y 6 minutos. Ambas sesiones estuvieron separadas por 1 hora y 15 minutos. La línea base 1 (LB1) consistió en la medición de la respuesta atáxica a través del grado de deslizamiento de cada sujeto en ausencia del efecto del etanol (0 EI), por lo que los sujetos recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina. La línea base 2 (LB2) consistió en la medición de la respuesta atáxica luego de la primera administración intraperitoneal de la dosis de etanol (EI).

Adquisición. Entre los días 2 y 23 los sujetos recibieron un ensayo diario de adquisición consistente en una inyección intraperitoneal de etanol, antes de ser inmediatamente regresados a la caja experimental donde permanecieron otros 5 minutos en presencia de los efectos del etanol. El día 23 se midió la respuesta atáxica en presencia del efecto del etanol (EI). Para obtener esta medida, se administró una inyección intraperitoneal de etanol y se realizaron dos mediciones en las mismas condiciones que la medición de línea base 2.

Extinción. Los días 24, 25 y 26 se llevó a cabo el entrenamiento de extinción, que consistió en tres ensayos diarios durante tres días, con un total de nueve ensayos. Cada uno consistió en la administración de una inyección intraperitoneal de solución salina, luego de la cual los sujetos permanecieron cinco minutos en el plano de deslizamiento. Cada ensayo estuvo separado por una hora.

Readquisición. Los días 27 y 28 se realizó la readquisición. El día 27 se midió la respuesta atáxica en las mismas condiciones en que se registraron la línea base 2, por lo que se administró una inyección intraperitoneal de etanol a cada sujeto y se lo ubicó inmediatamente en el plano de deslizamiento. Este procedimiento se consideró un primer ensayo de readquisición. El día 28 se procedió de la misma manera y esta medición se consideró una evaluación de la readquisición.

Análisis de resultados. Se realizó un análisis de varianza (Anova) de medidas repetidas sobre los promedios de las mediciones en los 4 y 6 minutos en cada fase de medición, lo cual fue realizado para ambos experimentos. Se consideraron factor intra-sujeto cinco mediciones diferentes, siendo estas línea base 1, línea base 2, adquisición, extinción y readquisición. Se realizaron comparaciones planeadas para evaluar hipótesis específicas usando el error total del Anova.

Resultados

Se encontró un efecto principal entre las distintas mediciones, F (4,28) = 56,19,p < 0,001, n_p ² = 0,89, MSE = 27,18. Como se puede observar en la figura 1, las ratas alcanzaron un mayor grado de inclinación cuando fueron medidas por primera vez en la caja de deslizamiento en ausencia del efecto del etanol (LB1) en comparación con la primera vez que recibieron etanol (LB2), F (1,7) = 199,21, p < 0,001, n_p ² = 0,96.

Figura 1 Resultados experimento 1. El gráfico presenta el promedio de los grados de inclinación alcanzados por los sujetos en las distintas fases del experimento 1. Las barras de error corresponden al error típico de la media 

En presencia del etanol y luego de 20 ensayos de adquisición las ratas alcanzaron un mayor grado de inclinación en comparación con la primera vez que recibieron etanol (LB2), F (1,7) = 51,35, p < 0,001, n_p ² = 0,88, lo que sugiere que los sujetos desarrollaron tolerancia a los efectos del etanol producto de la administración. Luego de la extinción, se observa que las ratas alcanzan menores grados de inclinación en el plano de deslizamiento cuando se compara con los de adquisición, F (1,7) = 51,04, p < 0,001, n_p ² = 0,87. Finalmente, el efecto del primer ensayo de readquisición comparado con el segundo, F(1,7) = 66,50,p < 0,001, n_p ² = 0,90, muestra que la tolerancia al etanol se recuperó rápidamente tras un ensayo de readquisición.

Experimento 2

Los resultados del experimento 1 mostraron que la tolerancia al etanol se puede extinguir luego de solo 9 ensayos de extinción, y que se puede detectar rápida readquisición luego de una única presentación de la clave, seguida del efecto del etanol después de la extinción. El experimento 2 examinó, por tanto, si el aumento del número de los ensayos de extinción (extinción masiva) tiene algún efecto en la readquisición de la tolerancia al etanol. El experimento fue conducido de manera similar al anterior, con la diferencia de que la extinción consistió de 84 ensayos en vez de 9. Basados en la evidencia de que la extinción masiva logra evitar la recuperación de respuesta (renovación; ^{Denniston et al., 2003}; ^{Laborda & Miller, 2013}; ^{González et al., 2016}), se esperaba que los niveles de tolerancia no se diferenciaran entre la medición posterior a la extinción y la posterior al ensayo de readquisición.

Método

Sujetos, aparatos y estímulos. Los sujetos fueron 8 ratas albinas macho (Sprague-Dawley), sin experiencia previa, de aproximadamente 90 días de edad y un peso entre los 220 y los 270 g. Las ratas fueron mantenidas en condiciones similares a las descritas en el experimento 1. Los materiales y estímulos utilizados en este experimento fueron similares a los del experimento 1, excepto en los casos que se mencionan a continuación.

Procedimiento. El diseño del experimento 2 se encuentra ilustrado en la tabla 2. El procedimiento fue similar al experimento 1, con la diferencia de que los sujetos recibieron 84 ensayos de extinción, distribuidos en 28 días.

Tabla 2 Diseño del experimento 2 

Resultados

Un Anova de medidas repetidas sobre los promedios de los dos ensayos en cada fase de medición encontró diferencia entre estas, F (4,28) = 113,10, p < 0,001, n_p ² = 0,94, MSE = 20,36. Como se puede observar en la figura 2, las ratas alcanzaron un mayor grado de inclinación cuando fueron medidas por primera vez en la caja de deslizamiento en ausencia de los efectos del etanol (LB1) en comparación con la primera vez que recibieron etanol (LB2), F (1,7) = 397,21, p < 0z.001, n_p ² = 0,98.

Figura 2 Resultados experimento 2. El gráfico presenta el promedio de los grados de inclinación alcanzados por los sujetos en las distintas fases del experimento 2. Las barras de error corresponden al error típico de la media 

Con presencia de etanol y luego de 20 ensayos de adquisición, las ratas alcanzaron un mayor grado de inclinación, en comparación con la primera vez que recibieron etanol (LB2), F (1,7) = 111,19, p < 0,001, n_p ² = 0,94. Como en el experimento 1, esto sugiere que los sujetos desarrollaron tolerancia a los efectos del etanol. Luego de la extinción, se observó que las ratas alcanzaron menores grados de inclinación en el plano de deslizamiento al ser comparados con las mediciones realizadas posterior a la adquisición, F (1,7) = 72,74, p < 0,001. n_p ² = 0,91. Finalmente, el resto de los efectos no alcanzaron a ser significativos. Dado que no hubo diferencias significativas en la respuesta atáxica entre los ensayos de readquisición, los resultados sugieren que la extinción masiva atenuó la readquisición de la tolerancia al etanol.