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Introducción
Los sistemas ganaderos de producción especializada de leche a nivel mundial, se ven afectados en el componente productivo por la presentación de la mastitis subclínica bovina, ya que es una de las enfermedades que impacta negativamente sobre la productividad de los hatos lecheros, en consideración al elevado costo en los tratamientos médico veterinario y a la disminución del nivel productivo (Hansen et al., 2004). La mastitis bovina subclínica, se caracteriza por no presentar signos clínicos visibles en el animal, pero si disminución en la producción láctea y un conteo elevado de células somáticas (Hillerton et al., 2005).
Las bacterias causantes de la mastitis bovina pueden ser clasificadas como patógenos mayores y menores de la glándula mamaria. Los patógenos mayores incluyen Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Actinomyces pyogenes, y las enterobacterias Escherichia coli, Klebsiella spp y Enterobacter spp., los cuales son contagiosos y las bacterias consideradas ambientales como Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus uberis. Los patógenos menores incluyen Mycoplasma, Pasteurella, Nocardia, Listeria, y algunos hongos y levaduras (Archbald, 1999).
Los patógenos que incluyen Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium spp (actualmente clasificado como Arcanobaterium spp) y Mycoplasma spp (Pellegrino et al., 2011) son microorganismos transmitidos de vaca a vaca a través de las manos del ordeñador, las toallas de secado utilizadas para limpiar los pezones, la leche residual en las pezoneras o un equipo de ordeño con inadecuada desinfección que alberga los patógenos, es decir, se transmiten estos patógenos como consecuencia de una mala rutina de ordeño (Radostits et al., 2002). Las bacterias que ocasionan con mayor frecuencia mastitis subclínica son Streptococcus agalactiae (Keefe y Chaffer, 2010), los Staphylococcus (Taponen y Pyorala, 2009), como Staphylococcus coagulasa negativos (ECN) (Thorberg et al., 2009), Staphylococcus coagulasa positivos (ECP) (Fox, 2009) y Staphylococcus aureus (Taponen y Pyorala, 2009).
La mastitis subclínica afecta el estado de la salud de la ubre que, para la industria láctea, es medida en la cantidad de células somáticas (RCS) de la leche, que se traduce en productos de menor calidad, menor tiempo de vida en anaquel y el acceso restringido a mercados internacionales con estándares más exigentes (Gasque y Blanco, 2001). La presente investigación tuvo como objetivo determinar las principales bacterias presentes en muestras de leche en dos sistemas de ordeño de vacas de la raza holstein con mastitis subclínica.
Materiales y métodos
Localización y población de estudio
Se evaluaron un total de 289 muestras de leche de vacas clínicamente sanas (138 provenientes de ordeño manual y 151 de ordeño mecánico), distribuidos en 11 hatos de cuatro municipios pertenecientes a la subregión Norte del departamento de Antioquia (Don Matías, San José de la Montaña, Santa Rosa y Yarumal; Tabla 1). El criterio de selección de los hatos incluidos, se relacionó con que las vacas tuvieran un nivel de RCS por encima de 300.000/ml en los controles lecheros realizados en los dos meses anteriores.
Toma de las muestras de leche
Previo lavado y desinfección, el personal encargado realizó el despunte de cada cuarto, posteriormente se realizó desinfección de cada pezón con alcohol etílico al 70% empleando un copo de algodón por cuarto. La limpieza y el muestreo de la leche contenida en los pezones se realizaron en el sitio de ordeño. Luego, de la leche muestreada de cada animal, se procedió a tomar 30 ml de leche como pool de los cuatro cuartos, que se depositó en un recipiente de plástico, estéril debidamente marcado, se refrigeró y se llevó al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia. Además, a cada vaca se le tomó una muestra de leche con el conservante Bronopol® para recuento de células somáticas.
Cultivo bacteriológico de leche
Para la caracterización de los patógenos bacterianos implicados en el desarrollo de la mastitis bovina, se siguió el protocolo interno del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia. Brevemente, las bacterias se identificaron por tinción de Gram y posteriormente se efectuaron pruebas confirmatorias. A los cocos Gram positivos se les efectuó la prueba de la catalasa para diferenciar los estreptococos de los estafilococos. Si se observaban Cocos Gram Positivos y la catalasa es positiva se realizaba la prueba de la coagulasa, si la prueba era positiva se reportaba como Staphylococcus aureus, si por el contrario, era negativa se reportaba como Staphylococcus coagulasa negativa. Cuando en el Gram se observaban Bacilos Gram Positivos en empalizada compatibles con Corynebacterium spp, y se le realizaba identificación por medio del Kit BBL CrystalTM para la identificación (ID) de bacterias gram-positivas (GP). Muestras de leche con aislamiento de tres o más patógenos fueron clasificadas como contaminadas y no se tuvieron en cuenta para los análisis estadísticos
Determinación del recuento de células somáticas (RCS) y conversión a score de células somáticas (SCS)
Una muestra de 30 ml de leche de cada vaca fue enviada al Laboratorio de calidad e inocuidad de la leche la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia. El análisis, se realizó mediante el uso de equipos con tecnología CombifossTM para RCS, los cuales fueron calibrados bajo metodologías internacionales de referencia AOAC 986.33, BS ISO 21187 (IDF 196, 2004), para bacterias mesófilos aerobias y la ISO 13366-1, 2008 (IDF 148-1, 2008), para células somáticas. El RCS determinado en cada muestra fue transformado a una escala lineal para obtener el puntaje de células somáticas (SCS) de 1 a 10, mediante una transformación logarítmica, según la expresión Log2(RCS/100000)+3, de acuerdo con lo descrito por Dabdoub y Shook (1984).
Análisis estadístico
Se utilizaron tablas de frecuencia para presentar el número de animales positivos y negativos al asilamiento de cualquier patógeno, para el número de hatos muestreados por municipio y para el número de animales muestreados en cada uno de los tipos de ordeño (manual y mecánico).
Para determinar la asociación del alto o bajo SCS con la presencia o ausencia de patógenos (cualquier tipo de patógeno obtenido en las muestras de cultivo microbiológico o el patógeno de mayor reporte en mastitis subclínica Streptococcus agalactie) se determinó el intervalo de confianza y el ODDS Ratio (OR), a través de una regresión logística Cerda et al., (2013).
El Chi-cuadrado se utilizó para determinar si el OR era estadísticamente significativo (P<0,05). El análisis estadístico se realizó en el programa SAS® versión 9.2 para Windows (SAS Institute Inc, Cary NC, USA) 2009.
Resultados
Cultivo y aislamiento de microorganismos
Se realizaron cultivos microbiológicos de 289 muestras de leche procedentes de pool de los cuatro cuartos, cuyos resultados se presentan en la tabla 2. Del total de las muestras el 29,86% no presentó crecimiento bacteriano y el 3,47% fueron clasificados como muestras contaminadas (más de tres patógenos aislados) datos que se eliminaron de los análisis de acuerdo a los lineamientos de la National Mastitis Council (N.M.C., 1999). La bacteria más frecuentemente aislada fue Arcanobacterium haemolyticum con un 20,14% de manera individual y un 0,7% en coinfecciones. El Staphylococcus coagulasa negativa ocupó el segundo lugar de aislamiento con presencia en el 17,36% de las muestras de forma individual y en el 1,04% en coinfecciones, seguido de Streptococcus agalactiae en el 12,50% individualmente y 1,38% en coinfecciones y en cuarto lugar el Staphylococcus aureus en el 10,42% en aislamientos solo y 1,04% en coinfección; la totalidad de las coinfecciones se presentaron en muestras de leche provenientes de ordeño mecánico (Tabla 2).
Tabla 2 Patógenos encontrados en los análisis microbiológicos de muestras de leche procedentes de vacas con mastitis subclínica.
Luego de tener los datos de aislamiento bacteriano en las 289 muestras de leche, se hizo un análisis de la distribución de los cuatro patógenos de mayor aislamiento (individual) en las muestras de leche en los dos sistemas de ordeño evaluados, que son 174 de las 289 muestras y se presenta en la tabla 3. Como se observa Arcanobacterium haemolyticum y Staphylococcus aureus se presentaron en mayor proporción en salas de ordeño mecánico, mientras que Staphylococcus coagulasa negativa y Streptococcus agalactiae se aislaron en mayor proporción en salas de ordeño manual.
Tabla 3 Patógenos en mayor proporción encontrados en la muestra de cultivo microbiológico y su proporción en cada tipo de ordeño (manual, mecánico)
Presencia de la infección según el sistema de ordeño
La infección por cualquier tipo de patógeno aislado en las muestras de leche en los dos tipos de ordeño tiene una diferencia estadística significativa con un valor (p= 0,0236), presentándose mayor porcentaje de aislamiento de patógenos bacterianos en muestras de leche proveniente de sistemas de ordeño mecánico.
Cuando se aisló Streptococcus agalactiae se determinó mayor porcentaje de repetición para este patógeno en sistemas de ordeño manual (p=0.0046)
Asociación del SCS con la presencia o ausencia de patógenos por medio de los ODSS RATIO (OR)
Inicialmente se determinó el OR entre SCS y la presencia o ausencia de patógenos (Tabla 4) y se observó que cuando no hay aislamiento de patógenos en la muestra de leche el SCS es bajo (p <0,0001), mientras que el OR no fue estadísticamente significativo cuando hubo aislamiento de patógenos.
En la (Tabla 5) se ilustran las asociaciones entre SCC y el aislamiento de Streptococcus agalactiae, se encontró un OR significativo y positivo, es decir que el valor de SCS aumenta significativamente en presencia de este patógeno (p=0,0155).
Discusión
Los hallazgos del trabajo en relación al porcentaje de muestras sin aislamiento (29,86%) es mayor al encontrado en el reporte de Gasque y Blanco (2001), quien halló el 10% cuando la leche es sembrada en agar sangre; las razones que argumentan los autores indican que esto se presenta porque las bacterias son eliminadas intermitentemente, porque la bacteria fue inactiva por los mecanismos de respuesta inmune del hospedero, por bajas concentraciones de patógenos o por efectos de tratamiento antibiótico (Gasque y Blanco, 2001) que también es mayor al encontrado por Ramírez et al. (2011), quien encontró el 23,9% de muestras negativas, en muestras de leche analizadas con la prueba de Prueba de Mastitis California CMT positivo.
Teniendo en cuenta que las muestras de leche de la presente investigación provenían de hatos que tuvieron vacas que presentaron altos recuentos de células somáticas en dos controles lecheros anteriores y sin tratamientos antibióticos reportados, entonces se puede determinar que el no aislamiento es resultado de la eliminación intermitente del patógeno o que en realidad las vacas ya hubiesen expresado respuesta positiva por acción del sistema inmune, como lo reportan Clavijo et al. (2002) quienes informaron que el análisis microbiológico de la leche no garantiza, con total confiabilidad el aislamiento de bacterias, debido a que los animales con mastitis subclínica pueden eliminar al microorganismo causante de manera intermitente durante la lactancia, así como el uso de antibióticos, presencia de leucocitos y un alto contenido de células somáticas en la leche que inhiben el crecimiento bacteriano in vitro.
El patógeno de mayor frecuencia de aislamiento en el presente estudio fue Arcanobacterium haemolyticum con presencia en el 20,84% de las muestras evaluadas y los hallazgos superan en porcentaje al señalado por Calderón et al.,(2008 y 2010) quienes lo aislaron en un 8,44 % y 2.10% de las muestras respectivamente, pero es menor con respecto a lo encontrado por Reyes et al., en el 2005, quienes identificaron este patógeno en un 24% de las muestras leche de vacas sometidas a ordeño manual en Venezuela.
En cuanto a la bacteria Staphylococcus coagulasa negativaRamírez et al., (2001 y 2011) la aislaron en un 14,6% y 10,2% de las muestras de leche evaluadas respectivamente, mientras que Calderón et al. (2008 y 2010) lo encontraron en un 11,75% y un 0,3%, respectivamente. Los resultados de estas cuatro investigaciones son menores que los encontrados en la presente pesquisa por ser menor el porcentaje de aislamiento (18,4%). De otro lado Trujillo et al. (2001) y Leal et al. (2010) encontraron un 23% la positividad para Staphylococcus coagulasa negativa en muestras de leche en dos estudios aislados, resultados mayores a los encontrados en esta investigación.
El patógeno Streptococcus agalactiae que se aisló en un 13,8% en esta investigación fue menos frecuente que los hallazgos de Cardona et al., en el (2016) determinados en mastitis clínicas (31%). Otros estudios de muestras de leche aparentemente normal han sido contradictorios en sus hallazgos respecto Ramírez et al., (2001), donde aisló Streptococcus agalactiae en el 47%, mientras Reyes et al., en el 2005, obtuvo un 20 % en las muestras evaluadas y Pérez et al., (2008) reportó un 62,5% en sistema de ordeño manual. Leal et al., en el 2010 encontraron una incidencia del 26 % y Ramírez et al., (2011) evaluaron cultivos bacteriológicos de leche encontrando un 34% de animales positivos a Streptococcus agalactiae.
De otro lado varios investigadores han encontrado porcentajes de positividad a Streptococcus agalactiae menores a los determinados en esta investigación, como Aponte et al., (2007) que hallaron esta bacteria en el 9% de las muestras, y Calderón et al., (2008), la hallaron en un 6,84% de sus muestras. Este patógeno no ha tenido un comportamiento de aumento o disminución a través de las investigaciones reportadas en los diferentes periodos, pero se debe recalcar que en el presente estudio ocupo el tercer lugar de aislamientos, precedido por Arcanobacterium haemolyticum y Staphylococcus coagulasa negativa, patógenos que parecen estar aumentando su presencia en leche de vacas clínicamente sanas.
El patógeno Staphylococcus aureus en este estudio se aisló en un 11,46% de las muestras de leche proveniente de hatos lecheros ubicados en la subregión norte del departamento de Antioquia con predominio de vacas de raza holstein del; resultados similares a los obtenidos por Pérez et al., (2008) que hallaron la bacteria en un 12,5% de sus muestras provenientes del sistema de ordeño manual. Pero los valores de positividad para Staphylococcus aureus del presente estudio son bajos, comparados con los estudios de San Martín et al., en el 2002 quienes encontraron en Chile una positividad del 55,53%, Calderón et al., (2008) que aislaron en el 29,09% de sus muestras y valores superiores de aislamiento de Staphylococcus aureus, similar alos de Calderón et al., en el 2011 donde hallaron un 87,56 % en las muestras de leche evaluadas.
Todas las coinfecciones en este trabajo se presentaron en muestras de leche provenientes de sistemas de ordeño mecánico con valores menores al 1%, resultados similares a los que encontró Calderón et al (2008) en 2.854 vacas en producción de leche en el altiplano Cundiboyacense (Colombia) obteniendo infecciones mixtas del 1,2%.
Un hallazgo que se debe resaltar de la presente investigación es que el SCS es bajo en muestras de leche en la que no se aísla ningún patógeno bacteriano, y este SCS aumenta significativamente cuando está presente el Streptococcus agalactiae en la muestra de leche.
Según los resultados obtenidos en el presente estudio, hay mayor porcentaje de hatos con empleo de ordeño manual sin aislamiento bacteriano (32,14% en ordeño manual vs. 29,94% en ordeño mecánico) y hay menor porcentaje de aislamiento de cualquier patógeno en muestras de leche proveniente de vacas sujetas a sistemas de ordeño manual (68,26% ordeño manual vs. 76,78% en ordeño mecánico), resultados contradictorios a lo que se esperaba, ya que siempre se ha pensado que tiene mejor estatus sanitario la leche de vacas que se obtiene empleando ordeño mecánico.
Conclusiones
Se encontró que un 30% de las muestras de leche analizadas fueron negativas para aislamiento de bacterias. En los dos tipos de ordeño se aislaron Arcanobacterium haemolyticum, Staphylococcus coagulasa negativa, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae con mayor proporción en el sistema de ordeño mecánico. Arcanobacterium haemolyticum y Sthaphylococcus aureus se presentan con mayor frecuencia en ordeño mecánico y el Streptococcus agalactiae, se presenta con mayor incidencia en ordeño manual.
