2.1 Material vegetal

Se obtuvieron 20 kg de rizomas de Cúrcuma longa fresca en el corregimiento de Pueblo Tapao, municipio de Montenegro, departamento del Quindío, Colombia. El material se secó en un horno de recirculación de aire marca DiEs, de la línea THERMOLAB - Standard ASTM TH720, a una temperatura de 40 °C hasta peso constante. Posteriormente, se molieron en una trituradora marca Oster Professional Series Beehive Blender Pst2, y se pasaron por un tamiz número 10 con abertura de 2.0 mm.

2.2 Extracción de aceite esencial por HDAM y HD

HDAM: se modificó un horno microondas convencional (SHARP, modelo R-211KL (W), con una potencia máxima de 800 W; variable en incrementos de 80W y una frecuencia de 2450 MHz). El horno microondas se adaptó para la extracción realizando un agujero en la parte superior e instalando un condensador tipo Clevenger, teniendo en cuenta lo publicado por ^{Zheng et al. (2020}). En este sentido, se utilizaron 15 g de material vegetal para la correspondiente extracción, y el AE obtenido se almacenó a 4 ºC hasta su análisis. El porcentaje de rendimiento (% R) de AE se calculó de acuerdo con la ecuación 1.

HD: se sometieron 30 g de rizomas a HD durante 2 h usando un montaje tipo Clevenger, en una estufa comercial marca Haceb, con una potencia de 1100 W. Los experimentos se realizaron por triplicado y el porcentaje de rendimiento se obtuvo como su media aritmética. Los AE se secaron con Na2SO4 anhidro y se conservaron en viales ámbar a 4 °C hasta su uso (^{Modi et al., 2021}).

2.3 Optimización mediante MSR con un diseño experimental Box Behnken

Se implementó un diseño de DBB con 3 factores: tiempo de irradiación, potencia de microondas y volumen de disolvente, en 3 niveles [bajo (-1), medio (0) y alto (+1)], para investigar simultáneamente los efectos de los factores independientes sobre el rendimiento del AE. Estos factores se codificaron como se muestra en la tabla 1 (^{Boudraa et al., 2021}). Los niveles de los factores fueron tomados según la metodología propuesta por ^{Mollaei et al., (2019}), en el diseño de único factor.

En este diseño se evaluó el % R de los AE como variable de respuesta. Se realizaron 12 experimentos aleatorios, con tres réplicas aleatorias en el punto central (PC) que se aplicaron para probar el error experimental, como se observa en la tabla 2.

Los resultados experimentales se analizaron mediante ANOVA en el programa STATGRAPHICS. La significancia de cada variable se evaluó usando una probabilidad P de 0.05 como nivel de confianza. Se construyeron gráficas tridimensionales de superficie de respuesta, para obtener información detallada sobre el proceso de optimización.

2.4 Consumo eléctrico y emisión de CO2

Un factor importante a tener en cuenta es la cantidad de energía utilizada durante el proceso de extracción y el impacto ambiental relacionado, que depende de la potencia de los equipos empleados y del tiempo de extracción. El consumo de energía se calcula mediante la ecuación 2.

Donde, E es el consumo de energía (kWh), P es la potencia aplicada (kW) y t es el tiempo de extracción (h).

La emisión de CO2 es la cantidad de dióxido de carbono gaseoso liberado a la atmósfera durante la extracción y estimado de acuerdo con la literatura (^{Chen et al., 2022}; ^{Drinić et al., 2021}; ^{López-Hortas et al., 2020}). Para obtener 1 kWh, se liberará a la atmósfera una cantidad de 800 g de CO2 por la combustión de combustible fósil. La emisión de CO2 se calcula mediante la ecuación 3.

Donde, E CO2 (g CO2) es la emisión de CO2 y E (kWh) es el consumo de energía.

2.5 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CGEM)

Los AE fueron analizados por CG-EM en un equipo marca SHIMADZU serie QP2010 ultra. El método utilizado implementó helio como gas portador, con un flujo de 1 mL/min, las muestras se prepararon diluyendo en una relación 1:20 v/v con diclorometano y se inyectó 1μL en modo Split. Se utilizó una columna Zebron ZB-5MS 5% Polisilarileno - 95% polidimetilsiloxano (30 m L × 0.25 mm ID × 0.25 μm df). Las temperaturas de la columna, el inyector y la línea de transferencia se ajustaron a 40, 300 y 300 °C, respectivamente. La rampa de calentamiento se programó inicialmente a la temperatura de la columna y se ajustó a 40 °C manteniéndose constante durante 2 min, luego se incrementó gradualmente hasta llegar a una temperatura de 260 °C, a una velocidad de 5°C por min. Alcanzada esta temperatura, se efectuó un incremento a 310 °C a una velocidad de 20 °C por min, manteniéndose inalterada por 3 min. El espectrómetro de masas utilizado posee un sistema de ionización de impacto electrónico de 70 eV, los análisis se efectuaron en modo Scan, con un intervalo de análisis de 40 a 450 en relación m/z. Los componentes del AE se identificaron por similitud de sus tiempos de retención, índice de Kovats y espectros de masas proporcionados por la biblioteca NIST 2013. Además, los componentes con similitudes menores al 95 % fueron identificados de acuerdo con ^{Adams (2017}), mediante la comparación de sus índices Kovats y sus espectros de masa, determinados sobre la base de los tiempos de retención de n-alcanos C8 -C25.

3.1 Diseño experimental de Box Behnken

En la tabla 3 se observan los datos experimentales del DBB obtenidos bajo diferentes combinaciones, y la variable de respuesta, que en este caso es el % R de los AE.

Los coeficientes de correlación evaluados de los términos lineales (A, B, C), cuadráticos (A2, B2, C2) y de interacción (AB, AC, BC) del modelo se muestran en la tabla 4, así como el análisis de varianza para % R del AE.

3.2 Análisis de varianza para % rendimiento del AE

La aceptabilidad del modelo se evaluó mediante la falta de ajuste de los valores P. El análisis de varianza demostró una falta de ajuste no significativa para todas las respuestas (P > 0,05), lo que afirma que el modelo es preciso y satisfactorio.

El estadístico R2 sugiere que el modelo explica 99,5664% de la variabilidad en porcentaje de rendimiento del AE. Adicionalmente, el estadístico R2 ajustado 98,786% es el más adecuado para comparar modelos con diferente número de variables independientes. Los resultados indican que, R2 y R2 ajustada están muy cerca uno del otro, sugiriendo que los valores experimentales están próximos a los predichos por el modelo. La tabla ANOVA para el porcentaje de rendimiento de los AE muestra que 7 efectos tienen un (P < 0.05), sugiriendo que son significativamente diferentes de cero, con un nivel de confianza del 95,0 %, como se muestra en el gráfico de Pareto (figura 1).

Figura 1 Rendimientos globales estandarizados en el diagrama de Pareto con efecto negativo (azul) y efecto positivo (gris). 

En la figura 1 se observa que los términos lineales A, B y el término cuadrático A2 son los factores que más afectan la extracción de los AE, con p valores de 0.006, 0.007 y 0.0046, respectivamente. La ecuación 4 representa la regresión polinomial de los factores, que afectan la extracción de los AE.

Donde A, B, C son las variables independientes estudiadas y Y es la variable de respuesta para el % R del AE. En la ecuación 4 los signos positivos y negativos, muestran efectos sinérgicos (+) y antagonistas (-) en la extracción de los AE.

3.3 Optimización de las variables involucradas en la HDAM

Para verificar la interacción entre los parámetros de extracción y la variable de respuesta, se analizaron los gráficos de superficie de respuesta (GSR) como se muestra en las figuras 2, 3 y 4.

Figura 2 Superficie de respuesta estimada en función del tiempo de extracción Vs la potencia del microondas. 

Figura 3 Superficie de respuesta estimada en función del tiempo de extracción y el volumen de disolvente. 

Figura 4 Superficie de respuesta estimada en función de la potencia (B) y el volumen de disolvente. 

Comparación de la eficiencia de extracción del AE obtenida por HDAM optimizado y HD convencional

Mediante el análisis de superficie de respuesta del modelo de regresión y para maximizar el rendimiento del AE de los rizomas de Cúrcuma longa, se encontró que las condiciones óptimas de extracción para la HDAM correspondieron a un volumen de 132,19 mL, un tiempo de extracción de 59 min, y una potencia de 720 W. En estas condiciones de extracción, el modelo de regresión predice que el rendimiento del AE es de 4.6 %. La figura 5 muestra la combinación de niveles de los factores que maximiza la función de deseabilidad en la región indicada para una condición óptima.

Figura 5 Superficie de respuesta estimada en función de deseabilidad. 

Teniendo en cuenta los parámetros de optimización obtenidos, se realizó por triplicado la HDAM, dando como resultado 4.88 ± 0.0360 %, valor altamente cercano al predicho por el modelo. Además, se obtuvieron los AE por HD convencional, con un % R de 3.306 ± 0.046 %, es decir 32 % menos que por el método HDAM. Los resultados se compararon con reportes previos donde se realizaron extracciones del AE de rizomas secos de Kaempferia galanga (Zingiberaceae) a través de HDAM y HD, análisis por MSR y de varianza (ANOVA), encontrando que el mayor rendimiento del AE se obtuvo a una potencia de 800 W, 28,38 min y relación sólida/líquido de 100 g/488,8 mL, soportando la importancia de la MSR como una potente herramienta matemática y estadística para optimizar las variables involucradas en el proceso de HDAM (^{Hearunyakij y Phutdhawong, 2022}).

3.4 Consumo eléctrico y emisión de CO2

Los impactos ambientales se evaluaron mediante el cálculo del consumo de energía y las emisiones de CO2. Los valores de consumo de energía de la HDAM y HD fueron 0.708 kWh y 2.2 kWh, respectivamente. Los resultados sugieren que el uso del microondas como método de extracción genera un ahorro energético considerable equivalente a 2 veces menos que lo requerido en la HD, además de que por HDAM se obtuvo un mayor rendimiento en menor tiempo. Este estudio se comparó con algunos resultados obtenidos por otros autores y en otras especies, donde analizaron la HDAM con la HD para extraer el AE de las cortezas de Cinnamomum cassia (Lauraceae), encontrando que la HDAM requirió solo 0,4 kWh (250 W durante 90 min), en comparación con el HD que consumió 1,0 kWh (350 W durante 150 min) (^{Jeyaratnam et al., 2016}). Reportes de la extracción del AE de flores de lavanda por HDAM, confirmaron también un ahorro en el consumo de energía de 3.154 kWh con respecto a la HD (^{Filly et al., 2016}).

En este sentido, el consumo de energía en la HDAM es proporcional al tiempo y la potencia aplicada. Sin embargo, algunas investigaciones encontraron que el uso de la irradiación por microondas no disminuyó la cinética de extracción, lo que llevó al aumento del consumo de energía; esto tal vez se debe a que las condiciones de operación del método de extracción no fueron optimizadas, lo que haría necesaria su optimización antes de realizar la extracción (^{Benmoussa et al., 2023}).

En el presente estudio, las implicaciones ambientales se relacionan con el consumo total de energía con respecto a la huella de CO2 emitido. . En este sentido, las emisiones de CO2 fueron 566 g para HDAM y 1760 g para HD, lo que implica una notable reducción cuando se utiliza la HDAM. En investigaciones donde se optimizaron los parámetros de extracción en la HDAM, por ejemplo, en la extracción del AE de la corteza de Cinnamomum cassia, la cantidad de emisión de CO2 fue de 330 g después de 90 min de HDAM bajo 250 W, contra 779 g CO2 tras 150 min de la HD a 350 W (^{Jeyaratnam et al., 2016}). En otro reporte sobre la extracción del AE de la misma especie, C. cassia, se encontró menor liberación de CO2 a la atmósfera: 238,4 g CO2 (durante 30 min) contra 2761,6 g CO2 por HD (durante 120 min) (^{Benmoussa et al., 2023}). Al comparar los resultados obtenidos en el presente estudio con los mencionados anteriormente, se puede sugerir que probablemente las emisiones de CO2 están directamente relacionadas con la energía utilizada y el tiempo de extracción. Por tanto, se considera necesaria la optimización de los parámetros de funcionamiento para las extracciones de AE (^{Ait Amer Meziane et al., 2020}).

3.5 Composición química de los AE

En los AE se identificaron un total de cincuenta (50) componentes, estos representaron el 97,77 % para HD y 99,67 % para HDAM. Además, se encontraron a los sesquiterpenos oxigenados como la familia estructural más abundante para ambas metodologías, con porcentajes que oscilan entre el 89 y 78 %, respectivamente (ver tabla 5).

En la figura 6 se puede observar la Ar-turmerona α-turmerona y β-turmerona, como los componentes mayoritarios obtenidos en este estudio, tanto para la HD como para HDAM.

Figura 6 Principales componentes de los AE obtenidos. 

Los AE extraídos por HDAM mostraron un aumento en los componentes mayoritarios con respecto a la HD, correspondiente al 11 % para Ar-turmerona, 31 % α-turmerona y 13.5 % para la β-turmerona. Esto puede deberse al efecto de la radiación por microondas, ya que en este proceso las interacciones con el campo electromagnético son responsables de la transferencia de energía al material vegetal. Es importante aclarar que el contenido de agua dentro del material vegetal determina el grado de absorción de la radiación. En este sentido, la conducción iónica y la rotación del dipolo son mecanismos de transferencia de energía, dado que la dirección del campo electromagnético cambia rápidamente y las moléculas intentan alinearse continuamente. Así, la energía cinética generada y la fricción inducida por la colisión de dipolos cercanos produce calor, que da como resultado una diferencia de presión al interior y el exterior de las células vegetales, provocando la ruptura y difusión del AE hacia el medio. Estos fenómenos aceleran la extracción y aumenta el rendimiento (^{Radivojac et al., 2020}).

Los resultados obtenidos concuerdan con lo reportado por ^{Radivojac et al. (2020}), quienes informaron que los principales constituyentes de los AE de Cúrcuma longa fueron Ar-turmerona (24,4%), α-turmerona (20,5%) y β-turmerona (11,1%) en rizoma fresco y Ar-turmerona (21,4%), α-santaleno (7,2%) y Ar-curcumeno (6,6 %) en rizomas secos. En otro estudio, ^{Singh et al. (2010}), informaron que la Ar-turmerona (30,3 %), la α-turmerona (26,5 %) y la β-turmerona (19,1 %) fueron los componentes mayoritarios en este AE. Mientras tanto, ^{Kutti Gounder y Lingamallu (2012}), reportaron la composición de AE de dos variedades de Cúrcuma longa cultivadas en Etiopía, y encontraron como componentes mayoritarios a la α-turmerona (32,41 y 35,16%), Ar-turmerona (25,20 y 25,47%) y β-turmerona (17,98 y 18,19%).

No obstante, otras investigaciones han reportado a la Ar-Turmerona como componente mayoritario (Jugreet et al., 2020). Estas variaciones en el contenido metabólico de los AE se deben, posiblemente, a factores, como: la etapa de desarrollo de la planta, período de cosecha y postcosecha, variación de las condiciones meteorológicas, variación geográfica/altitudinal, variación genética, método de extracción, tiempo de secado y tiempo de extracción (Jugreet et al., 2020).

Los AE de Cúrcuma longa presentan una amplia actividad biológica, y algunos autores sostienen que esta actividad depende principalmente de sus componentes mayoritarios. Estudios in vitro han sugerido que tienen actividad antiinflamatoria, inmunomoduladora, anticancerígenas, antifúngicas y efectos inhibitorios sobre la β-secretasa, un posible contribuyente al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. También se ha demostrado que la Ar-turmerona tiene efectos antiangiogénicos en células endoteliales humanas HMEC-1 (^{De Souza Tavares et al., 2016}; ^{Mallmann et al., 2017}; ^{Singh et al., 2010}; ^{Zhang et al., 2017}; ^{Zheng et al., 2020}). Así mismo, se han reportado efectos inhibidores antiplasmodiales y específicos contra Plasmodium falciparum (^{Yue et al., 2015}), y antioxidantes e inmunomoduladores, sobre Leishmania major, el agente causante de la leishmaniasis cutánea zoonótica (Ali et al., 2020).