Morfología del fruto y de la semilla

Se recolectaron 30 frutos maduros de seis árboles en los municipios de Centro y Nacajuca, Tabasco, México a los que se les midió la longitud y el diámetro en la parte media, se registró su peso total y el porcentaje de pulpa. Se extrajeron las semillas y se cuantificó su número por fruto, así como su ancho, longitud y peso unitario con una balanza analítica Ohaus con 1 mg de precisión, después de dejarlas secar por cuatro días a temperatura ambiente (25,3 ± 1,0 °C). Para la obtención del corte mediano de las semillas, se escarificaron mecánicamente igual que en el tratamiento pregerminativo y se remojaron por 48 h para facilitar el corte y poder observar su estructura interna.

Germinación

Las semillas extraídas se sometieron a los siguientes tratamientos pregerminativos: T1: Testigo, T2: Escarificación mecánica con tijera de podar. T3: Remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 3 h), T4: Remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 6 h), T5: remojo en ácido giberélico a 200 mg L^-1 por 3 h, T6: Escarificación mecánica + remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 24 h). La escarificación mecánica consistió en realizar un corte en la cubierta seminal de 5 mm en la zona opuesta al micrópilo.

Como fuente de ácido giberélico se utilizó un producto comercial, equivalente a 3,46 g L^-1 de i.a. Las semillas se sembraron en vasos plásticos de 300 mL de capacidad, utilizando un sustrato con una mezcla de arena, tierra negra y fibra de coco (1:1:2 v/v); el sustrato se desinfectó a saturación con fungicida (Captán, 2 mg L^-1). El trabajo experimental se realizó en condiciones de laboratorio: temperatura máxima: 25,6 ± 0,9 °C, temperatura mínima: 25,0 ± 1,0 °C y una humedad relativa promedio de 75 ± 6 %.

La descripción de las plántulas se realizó con base en ^{Duke (1969)} e ^{Ibarra-Manríquez et al. (2001)} de acuerdo al tipo de cotiledones (foliáceos o de reserva) y si emergen o no al germinar (fanerocotilar o criptocotilar). Se llevó registro del desarrollo de la plántula en días después de la siembra (dds).

Diseño experimental y análisis de datos

A los datos morfológicos de los frutos y semillas se les aplicó estadística descriptiva con registro de medias y desviación estándar.

El diseño experimental de la germinación fue completamente aleatorio de seis tratamientos y cinco repeticiones por tratamiento de seis semillas como unidad experimental. Se calcularon: porcentaje de germinación (PG) y tasa de germinación (TG); el primero se obtuvo con la relación porcentual de semillas germinadas luego de 37 días; para el cálculo de la TG se sumaron los cocientes de los porcentajes de germinación y su respectivo día de evaluación con base en la fórmula de ^{Maguire (1962)}, ajustada por ^{Pire y Vargas-Simón (2019)}. Se realizó un análisis de varianza luego de comprobar los supuestos de normalidad y homo-cedasticidad; y prueba de medias de Tukey utilizando el programa ^{Statistix 8.0 (2005)}. Para el análisis, los porcentajes de germinación fueron transformados a arcsen√x.

Morfología del fruto y de la semilla

El fruto es un sincarpio ovoideo a ovoideo esférico, específicamente en forma acorazonada con una depresión en la base (Fig. 1a). El pericarpio es de color rojizo, tiene una superficie más o menos lisa, las uniones de los carpelos apenas visibles (Fig. 1a), su pulpa es rojiza en los márgenes y blanca en la zona central (Fig. 1b), originalmente donde fue la zona de los pedicelos; tiene una consistencia cremosa y sabor dulce, representa una alta proporción con respecto al total del peso del fruto, de casi el 70 %. Los datos morfológicos de los frutos se observan en la Tabla 1.

Tabla 1 Características morfológicas del fruto y semillas de Annona reticulata. Medias ± desviación estándar. 

¹ tomadas al azar de 30 frutos.

Las semillas son lisas, comprimidas lateralmente café oscuras y brillosas, se cuantificaron en promedio: 116,8 por fruto, con una longitud de 14,5 mm y un peso de 0,3 g (Tabla 1); cuentan con un endospermo ruminado con placas de color café y un embrión pequeño, de aproximadamente 3 mm en semillas embebidas (Fig. 2).

Los frutos descritos fueron uniformes, aunque ^{Morton (1987)} y ^{García (2006)} afirman que pueden ser ovoides u obloides; el porcentaje de pulpa y el ancho de los frutos obtenidos es mayor que el referido por ^{García (2006)}, las demás características coinciden con la literatura (^{León 2000}, ^{Pinto et al. 2005}, ^{García 2006}).

Los valores del número y largo de semillas obtenidos en este trabajo son mayores que los descritos por ^{García (2006)} y ^{Pontes et al. (2018)}, prácticamente el doble para ambas variables, dichos autores reportan 52,8 semillas por fruto, de 6,9 mm de largo; ^{García (2006)} especifica 20,7 g como peso de semilla total.

El endospermo ruminado y el embrión basal pequeño (de 1/4) son característicos del género Annona (^{Niembro 1988}, ^{Svoma 1998}). El tejido ruminado es resultado de pliegues formados por fibras de la mesotesta y endotesta, peculiar en la familia Annonaceae (^{Velázquez et al. 2016}).

Germinación

La germinación de A. reticulata se registró como criptocotilar epígea con cotiledones de reserva, similar a las anonáceas Malmea depressa (Baill.) R.E. Fr. (^{Ibarra-Manríquez et al. 2001}), a Monodora myristica (Gaertn.) Dunal y a M. tenuifolia Benth (^{Ariwaodo 2019}), pero diferente al de otras anonas como Annona glabra L. (^{Zamora-C et al. 2009}) y Rollinia sylvatica (A. St.-Hil.) Martius (^{Mayer et al. 2008}), quienes tienen una germinación fanerocotilar epigea con cotiledones foliáceos. Describir la morfología de las plántulas es importante porque explica procesos de sucesión ecológica, la identificación de juveniles ayuda a distinguir taxonómicamente a las especies y a diferenciarlas de los individuos adultos, además es un conocimiento que se puede aplicar durante el manejo de vivero (^{Matos y Landim 2016}).

En la primera etapa se observó la curvatura del hipocótilo, este fue el estadio en que se consideró una semilla germinada (Fig. 3a), en este tipo de germinación los cotiledones de reserva no emergen (^{de Voguel 1980}). Posteriormente pasaron tres días para que el tallo se situara en una posición vertical. A los 40 dds emergieron sus eófilos alternos, simples, con limbo lanceolado, base cuneada, ápice largamente acuminado y nervaduras prominentes (Fig. 3b), esta descripción coincide en forma con las hojas adultas (^{Lawrence 2000}), esta secuencia fenológica es similar a la registradas en M. myristica y M. tenuifolia (^{Ariwaodo 2019}).

Figura 1 Aspectos del fruto de Annona reticulata. a. fruto entero, b. fruto diseccionado. Escala = 10 cm. 

A los 60 dds, las plántulas midieron 12 cm de longitud, se formaron dos eófilos de 5-6 cm de longitud y dos primordios foliares (Fig. 3b), posiblemente su tallo alcance los 35 cm en seis meses como lo describió ^{Nadukeri et al. (2018)} en la misma especie, en India. Los eófilos son las primeras láminas foliares desarrolladas en las plántulas, se consideran hojas verdaderas juveniles (^{Duke 1969}), son más pequeñas que las adultas, en este caso llegan a medir entre 10-20 cm de largo (^{Morton 1987}, ^{Lawrence 2000}). La cubierta seminal permaneció alrededor de 70 dds, posteriormente se suscitó su senescencia y abscisión.

Las semillas bajo el T2 y T3 iniciaron el proceso de germinación a partir del día 17 (26,6 y 16,6 %, respectivamente), los demás tratamientos el día 19 (Fig. 4). El máximo porcentaje de germinación (76,6 %) se logró hasta el día 31 por el T2 (escarificación mecánica); en los tratamientos asociados al ácido giberélico no mejoraron sustancialmen-te la velocidad de germinación ni el porcentaje. El T3 (remojo en ácido giberélico a 100 mg L^-1 por 3 h) concluyó su germinación a los 29 días, pero resultando baja (56,6 %). El tratamiento combinado (T6: escarificación + AG₃) sólo alcanzó el 66,6 % y la última semilla germinada se registró hasta el día 37. Resultados análogos en cuanto a la velocidad de germinación los registraron ^{Meza y Bautista (2004)}, quienes realizaron un trabajo con semillas de guanábana (A. muricata), donde el inicio del proceso fue a los 16 días; las semillas de A. muricata pueden terminar su proceso de germinación hasta los 71 dds, tiempo registrado después de un remojo en agua fría por 96 horas (^{Joseph-Adekunle 2014}).

El mínimo de germinación fue del 40 % que ocurrió en el T5 (remojo en ácido giberélico a 200 mg L^-1 por 3 h), el testigo tuvo una germinación de 43,3 % (Tabla 2), este valor fue mayor que el registrado por ^{Cartagena y Barreto (1998)}, quienes obtuvieron 32,9 % con semillas sin tratamiento de la misma especie provenientes de Colombia.

Figura 2 Semillas de Annona reticulata. Izquierda en corte mediano, mostrando endospermo ruminado (Er) y embrión (E), semilla embebida en agua por 48 h; derecha semilla completa, se observa la cubierta seminal y el micrópilo en la parte basal (M). Escala = 10 mm. 

Tabla 2 Porcentaje de germinación y Tasa de germinación de semillas de Annona reticulata con diferentes tratamientos pregerminativos. T1: Testigo, T2: Escarificación mecánica con tijera de podar. T3: Remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 3 h), T4: Remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 6 h), T5: remojo en ácido giberélico a 200 mg L^-1 por 3 h, T6: Escarificación mecánica + remojo en ácido giberélico (100 mg L^-1 por 24 h). 

CV = Coeficiente de variación. DMS = Diferencia Mínima Significativa. Medias seguidas por letras diferentes indican diferencias significativas según la prueba de Tukey (P≤0,05).

El ácido giberélico (AG₃) a la concentración y tiempos de remojo no fue eficiente para promover una germinación alta en esta especie (Fig. 4); el porcentaje de germinación en el tratamiento T5 fue menor incluso que el testigo (Tabla 2). El efecto del ácido giberélico sobre la germinación de A. reticulata fue similar al obtenido por ^{Stenzel et al. (2003)}, quienes aplicaron una dosis de 100 mg L^-1 de AG₃ en semillas de A. squamosa, resultando un 44 % de germinación. ^{Braga et al. (2010)}, aplicaron dosis de 100 mg L¹ de AG₃ en semillas de A. cherimola x A. squamosa, obteniendo un 60 % de germinación es decir un 16,6 % menos que el porcentaje obtenido en este trabajo por el T2.

Cabe resaltar que dentro del género Annona, salvo el estudio de Singh y Maheswari (2018) quienes lograron un 100 % de germinación aplicando AG₃ 500 mg L^-1 por 24 horas en A. muricata, las semillas de Annonaceae raras veces alcanzan la total germinación aun con tratamientos pregerminativos: en A. reticulata,^{Sneha (2016)} obtuvo un 83,3 % utilizando escarificación con ácido sulfúrico concentrado y 70,6 % con semillas remojadas durante 24 hs en AG₃ (^{Khot et al. 2019}). Otros autores han registrado valores máximos de 95,83 % para A. muricata con escarificación mecánica (^{Campos et al. 2008}), 85,5 % en A. cherimola x A. squamosa utilizando concentraciones de 778 mg L^-1 de AG₃, (^{de Oliveira et al. 2010}) y 77 % en semillas de A. squamosa usando 250 mg L^-1 i.a. de AG₃ (^{Ferreira et al. 2019}). ^{Da Silva et al. (2007)}, promovieron la germinación de A. crassi-flora Mart. en un 43 % con la aplicación de 500 µM de AG₃ .

El ácido giberélico es una fitohormona conocida por interrumpir el reposo en algunas especies de semillas mediante la síntesis de enzimas. Estas enzimas, incluyendo α amilasas, proteasas y lipasas, descomponen rápidamente las paredes celulares del endospermo e hidrolizan los almidones y las proteínas, liberando así las substancias y la energía necesaria para la germinación, aunque el efecto de las giberelinas es distinto en cada especie, porque depende de la concentración, exposición y sensibilidad a la fitohor-mona (^{Azcón-B y Talón 2008}, ^{Mendes et al. 2019}). Según ^{Khot et al. (2019)}, aparte del remojo de las semillas en ácido giberélico (250 mg L^-1) por 24 horas y usando un sustrato de suelo + FYM (mezcla de suelo y estiércol), facilitaron la germinación de A. reticulata, combinando la fitohormona con el suelo, mejorando en su estudio la disponibilidad de agua suficiente para ablandar la cubierta seminal.

Figura 3 Aspectos de la germinación de Annona reticulata: a. Semilla recién germinada (17 dds), mostrando el hipocótilo y la cubierta seminal (círculo); b. plántula de Annona reticulata de 60 días con un par de eófilos bien desarrollados. La flecha señala la cubierta seminal. 

La escarificación mecánica cumple la función de eliminar la barrera física que pudiera ofrecer una cubierta seminal dura o cerosa, lo que involucra hacer a la semilla más permeable al agua y a los gases (^{Coelho et al. 2010}), en el caso de las Annonaceae, la mesotesta de las semillas tiene células de paredes radiales engrosadas y lignificadas (^{Svoma 1998}), razón por la cual, en este trabajo la escarificación mecánica fue un tratamiento adecuado para esta especie o la aplicación de ácido sulfúrico en el estudio de ^{Sneha (2016)} en África; al respecto, ^{Ferreira et al. (2019)} afirman que la lenta imbibición pudiera evitar una germinación homogénea. Según ^{Baskin y Baskin (2004)}), cuando una semilla escarificada germina, se trata de una dormancia física no profunda.

El mayor porcentaje y la tasa de germinación están asociados para definir cuando una semilla podría tener la capacidad de producir una plántula normal (Barboza y Herrera 1990, ^{Still 1999}), el T2 fue el que presentó mayor TG (3,5) encontrándose diferencias significativas entre los tratamientos (_P<0,05) (Tabla 2), por lo tanto la germinación diaria (TG) y el porcentaje de germinación son estimadores de un buen desempeño de la semilla (^{Marcos-F 2005}). Comparando con otras especies de Annonaceae y variables similares como índice de vigor de las semillas e índice de velocidad de germinación, ^{Najorda y Rosales (2019)} consiguieron en el testigo dos semillas germinadas por día cuando el porcentaje de germinación fue de 78 %; ^{Braga et al. (2010)} obtuvieron valores entre 2,88-5,21 para A. cherimola x A. squamosa en tratamientos con diferentes fitohormonas (giberelinas, purinas y ácido indolbutírico) en diversas concentraciones y ^{Campos et al. (2008)} calcularon valores de 10,23-13,37 con un porcentaje de germinación del 95-95,8 % trabajando con A. muricata.

Es importante señalar que A. reticulata es de las especies de anonas comestibles menos domesticada, aunque los valores de las diferentes variables fueron similares a otras especies como A. emarginata 26-70,5 % (^{Corsato et al. 2012}) y entre 20-40 % de germinación en A. deceptrix (^{Pico-Mendoza et al. 2020}). Estudios posteriores deben enfocarse en revisar otros tratamientos pregerminativos para estimular la maduración del embrión. ^{Da Silva et al. (2007)} realizaron estudios con A. crassifolia y la clasificaron por tener una dormancia morfo-fisiológica superficial. A pesar de que las semillas se mantuvieron por seis días en ácido giberélico se promovió una germinación máxima del 43 %, aún menor a lo registrado en este trabajo para A. reticulata. Cabe resaltar que en observaciones directas, algunas semillas examinadas carecían de embrión, debido posiblemente a fallas en la polinización como afirman ^{Lobo et al. (2007)} en Annonaceae, lo que pudiera explicar también que aunque se aplica el tratamiento de escarificación, varias semillas fueron vanas.

Figura 4 Promedios y EE del porcentaje de germinación acumulado en función de tiempo de semillas de Annona reticulata en diferentes tratamientos T1= testigo; T2= escarificación mecánica con tijera; T3= remojo en ácido giberélico a 100 mg L^-1 por 3 h; T4= remojo en ácido giberélico a 100 mg L^-1 por 6 h; T5= remojo en ácido giberélico a 200 mg L^-1 por 3 h; T6= escarificación mecánica con tijera + remojo en ácido giberélico (100 mgL^-1 por 24 h). Las líneas se truncan al alcanzar su máximo valor. 

Se puede deducir que aún se requieren varios estudios sobre la especie, el tratamiento de escarificación mecánica en las semillas de A. reticulata puede ser el ideal para promover un alto porcentaje de germinación y en consecuencia se pueden establecer programas de propagación para su conservación y aprovechamiento intensivo en huertos familiares como se viene realizando como frutal o como sostén para especies trepadoras útiles, ya que el árbol por su arquitectura facilita este mecanismo, aparte tiene bajo índice de hojas que permite el crecimiento de otras plantas epífitas o trepadoras (^{Chávez-S et al. 2002}, ^{Rebollar et al. 2008}, ^{Vargas-S et al. 2010}).